法醫(yī)毒理學(xué)中藥物代謝與中國(guó)漢族人群CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、涉毒案件是法醫(yī)學(xué)鑒定的重要內(nèi)容之一。由于人類(lèi)對(duì)毒藥物的代謝存在顯著的個(gè)體差異，因而中毒案件的法醫(yī)毒理學(xué)分析應(yīng)充分考慮個(gè)體遺傳因素，結(jié)合藥物基因組學(xué)進(jìn)行結(jié)果解釋。細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是人體中最重要的藥物代謝酶。遺傳機(jī)制的研究顯示，藥物代謝的個(gè)體差異主要由CYP基因多態(tài)性所致，若CYP基因出現(xiàn)堿基缺失、插入、替換、顛換等類(lèi)型的突變，就會(huì)使氨基酸序列改變，導(dǎo)致所表達(dá)的CYP酶降低活性或者喪失活性，最終引起

2、藥物代謝異常而中毒。
　　單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）在人類(lèi)基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，在疾病相關(guān)性研究、藥物基因組學(xué)、法醫(yī)學(xué)等研究中發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)基于SNP分型的藥物基因組學(xué)逐漸在毒理學(xué)研究方面嶄露頭角，其不僅可用于篩選異常代謝人群，也可為毒理學(xué)作用機(jī)制的研究提供新的方向和方法。基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorp

3、tionionization-time of flight mass spectrum，MALDI-TOF MS)基因分型技術(shù)因其高靈敏度、高特異性、高通量等優(yōu)點(diǎn)，更符合法醫(yī)生物學(xué)檢材的要求，適用于CYP基因的SNP位點(diǎn)分型。生物樣品前處理方法一直以來(lái)是毒物分析的一個(gè)研究難點(diǎn)。分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technique，MIT)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型分子識(shí)別分離技術(shù)，因其識(shí)別性好、專(zhuān)一性高，可應(yīng)用于生物檢

4、材中毒藥物及其代謝物的分離分析。
　　本論文在國(guó)內(nèi)首次針對(duì)中國(guó)漢族人群CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4和CYP1A2基因座上的50個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了大規(guī)模篩查分析，并在現(xiàn)有研究成果以及現(xiàn)代毒物分析技術(shù)和SNP分型技術(shù)的研究基礎(chǔ)和起點(diǎn)上，以司法鑒定實(shí)踐中廣泛涉及的新一代非“苯二氮卓”藥物唑吡坦(Zolpidem，思諾思)和阿片類(lèi)藥物可待因?yàn)檠芯繉?duì)象，創(chuàng)建了體內(nèi)毒藥物及其代謝物的篩選分析體系和確證定量方法，自主

5、研發(fā)了唑吡坦分子印跡固相萃取小柱并申請(qǐng)專(zhuān)利，用于血液和尿液中唑吡坦的分離分析。通過(guò)志愿者實(shí)驗(yàn)，首次考察了中國(guó)漢族人群中CYP基因多態(tài)性的分布情況，首先報(bào)道了CYP基因多態(tài)性與唑吡坦及可待因代謝之間的關(guān)系，在國(guó)內(nèi)率先進(jìn)行了將藥物基因組學(xué)應(yīng)用于法醫(yī)毒理學(xué)的探索研究。主要的研究?jī)?nèi)容分為以下七部分:
　　第一部分 CYP基因分型方法的研究及評(píng)價(jià)
　　研究顯示，CYP2D6，CYP2C19，CYP2C9，CYP3A4和CYP1A2參與

6、了大部分的藥物代謝。篩選出這些基因座上的50個(gè)SNP位點(diǎn)，創(chuàng)建了基于復(fù)合PCR和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)的CYP基因分型方法，并檢測(cè)了200例健康中國(guó)漢族人群的血樣，得到了這50個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分布頻率。引物是根據(jù)MassARRAY Assay設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由0.5mL全血抽提基因組DNA，經(jīng)過(guò)復(fù)合PCR得到含SNP位點(diǎn)的片段。MALDI-TOF-MS檢測(cè)之前再經(jīng)過(guò)單堿基延伸和產(chǎn)物純化，即得到檢

7、測(cè)結(jié)果。同時(shí)以已知基因型的DNA樣品作為質(zhì)量控制樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4和CYP1A2基因座上的17個(gè)SNP位點(diǎn)具有多態(tài)性。首次報(bào)道8個(gè)位點(diǎn)(rs16947，rs28371725, rs1800754, rs4244285, rs4986893, rs12248560, rs3758580, rs2242480)的分布頻率在中國(guó)漢族人群和高加索人群中存在顯著性差異(p＜0.01)，2

8、個(gè)位點(diǎn)的分布頻率和現(xiàn)存中國(guó)漢族人群分布頻率之間存在顯著性差異(p＜0.01)。通過(guò)驗(yàn)證，所建立的MALDI-TOF-MS SNP分型方法的準(zhǔn)確度是100％。因此，該方法檢測(cè)結(jié)果可信且適用于高通量的基因分型研究，提高了法醫(yī)毒理學(xué)中毒藥物相關(guān)基因篩選的效能。
　　第二部分常見(jiàn)毒藥物的LC-MS/MS篩選體系的建立
　　為了研究體內(nèi)毒藥物的代謝情況，創(chuàng)建了生物檢材中170種常見(jiàn)毒藥物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromat

9、ography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)篩選分析體系。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）模式，以目標(biāo)物的保留時(shí)間和母離子/子離子對(duì)為指標(biāo)進(jìn)行篩選分析。建立了LC-MS/MS庫(kù)和定性認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)，并考察了分析方法的有效性。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)篩選體系兼具有選擇離子掃描的靈敏度和二級(jí)質(zhì)譜的特征性，血液中170種毒藥物篩選分析的最低檢出限為0.1～10ng/mL，其

10、中85％的毒藥物檢出限≤1ng/mL，達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。該篩選分析體系能滿足法醫(yī)毒物分析和臨床毒物學(xué)檢測(cè)中毒或治療濃度目標(biāo)物的需要，為其他多種藥物代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析提供了技術(shù)儲(chǔ)備，在司法鑒定實(shí)踐中有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　第三部分唑吡坦分子印跡固相萃取柱的制備及應(yīng)用
　　生物樣品尤其是血液、尿液中目標(biāo)物的分離分析技術(shù)是本課題研究的基礎(chǔ)。目前，生物檢材中的唑吡坦分析，主要采用液液提取或固相萃取等前處理后進(jìn)行液相色譜

11、串聯(lián)質(zhì)譜分析。分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technique，MIT)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型分子識(shí)別分離技術(shù)，因其識(shí)別性好、專(zhuān)一性高，可應(yīng)用于生物檢材中毒藥物及其代謝物的分離分析。本課題以唑吡坦為模板，自主研發(fā)了特異性強(qiáng)、選擇性高的分子印跡聚合物提取柱，建立了相應(yīng)的分子印跡固相萃取方法，并申請(qǐng)了一項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利。以血液為檢材，提取物用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)分析。對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并與傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)

12、進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)該分子印跡固相萃取柱選擇性強(qiáng)、靈敏度高（最低檢測(cè)限為0.2ng/mL），適用于法庭科學(xué)領(lǐng)域唑吡坦相關(guān)實(shí)際案例的檢測(cè)分析。
　　第四部分 UPLC-MS/MS法檢測(cè)血液、尿液中的唑吡坦及其代謝物
　　為研究唑吡坦的體內(nèi)代謝情況，本課題首次建立了同時(shí)檢測(cè)生物檢材中唑吡坦及其主要代謝物6-羧酸唑吡坦(zolpidem6-carboxylic acid，ZCA)及苯基-4-羧酸唑吡坦(Zolpidem phenyl-

13、4-carboxylic acid，ZPCA)的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析方法，并應(yīng)用于鑒定實(shí)踐。取0.1mL血液或尿液，加入0.9mL的乙腈（含0.1％甲酸）進(jìn)行蛋白沉淀。離心后取上清液吹干，用100μL甲醇定容后進(jìn)API4000Q分析，分析柱為AcquityTM UPLC HSS

14、T3(100 mm×2.1mm，1.8μm)柱。流動(dòng)相為乙腈和水（含20 mmol/L乙酸銨和0.1％甲酸），流速為0.5mL/min。血液中唑吡坦，ZPCA及ZCA的線性范圍分別為0.1-300ng/mL，0.1-500ng/mL，0.1-200ng/mL，尿液中唑吡坦，ZPCA及ZCA的線性范圍分別為0.1～600 ng/mL，0.1～600 ng/mL，0.1～300 ng/mL。三種化合物的檢出限和定量限分別為0.05 ng/m

15、L和0.1 ng/mL，方法的線性相關(guān)性≥0.9995，日間和日內(nèi)精密度在10％以?xún)?nèi)，回收率為70.0-98.3％，基質(zhì)效應(yīng)為79.5-99.0％。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，能夠有效地解決唑吡坦涉藥案件，提高突發(fā)案（事）件的快速鑒定能力。
　　第五部分唑吡坦代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析
　　以臨床廣泛應(yīng)用，并在藥物輔助犯罪案件(Drug-facilitated sexual assault，DFSA)中經(jīng)常涉及到的新一代

16、非“苯二氮卓”藥物唑吡坦為研究對(duì)象，為了考察唑吡坦代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性，選取200名漢族健康志愿者分析其基因型，篩選出具有突變基因的人群并分為4組:CYP3A4*18(wild-type，W)，CYP2C19*2(W); CYP3A4*18(mutant,M),CYP2C19*2(W); CYP3A4*18(W),CYP2C19*2(M); CYP3A4*18(M)，CYP2C19*2(M)。志愿者口服治療劑量的酒石酸唑吡坦后

17、采集其血液、尿液樣品進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，唑吡坦的氧化代謝主要是通過(guò)細(xì)胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。首次報(bào)道，若發(fā)生CYP3A4*18的突變，則會(huì)增強(qiáng)CYP3A4酶的活性，從而引起該基因突變?nèi)巳簩?duì)唑吡坦的代謝增強(qiáng);若發(fā)生CYP2C19*2的突變，則會(huì)降低CYP2C19酶的活性，從而引起中國(guó)漢族人群對(duì)唑吡坦的弱代謝。該研究成果提出，不同人群對(duì)唑吡坦的代謝存在個(gè)體差異，解釋相關(guān)案件時(shí)應(yīng)充分考慮個(gè)體遺傳因素。
　　第六部

18、分 UPLC-MS/MS法檢測(cè)尿液中的可待因及其代謝物
　　為研究可待因的體內(nèi)代謝情況，本課題創(chuàng)建了尿液中可待因及其代謝物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。以嗎啡-d3(MOR-d3)和嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷-d3(M3G-d3)為內(nèi)標(biāo)，尿樣用乙腈沉淀蛋白后，過(guò)SiroccoTM蛋白沉淀板，UPLC-MS/MS法分離檢測(cè)尿樣的中嗎啡(MOR)、嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷(M3G)、嗎啡-6-葡萄糖醛酸苷(M6G)和可待因(COD)。尿

19、樣中COD的檢出限為0.2ng/mL，定量限為0.5 ng/mL; MOR、M3G和M6G檢出限為0.5 ng/mL，定量限為1 ng/mL;線性相關(guān)系數(shù)r≥0.9997;日內(nèi)精密度在5％以?xún)?nèi)，日間精密度在10％以?xún)?nèi);日內(nèi)準(zhǔn)確度大于97％，日間準(zhǔn)確度大于94％，回收率在90％以上，基質(zhì)效應(yīng)在45％-90％。所建方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可適用于法醫(yī)毒理學(xué)中可待因相關(guān)案件的分析鑒定。
　　第七部分可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析

20、
　　以臨床廣泛應(yīng)用，并易造成濫用成癮的藥物可待因?yàn)檠芯繉?duì)象，為了考察可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性，選取20名健康志愿者口服治療劑量的復(fù)方磷酸可待因口服溶液后分時(shí)段留尿，采用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)志愿者在單次給藥0.5h內(nèi)，MOR、COD濃度即達(dá)到峰值，而M3G濃度則在1h后達(dá)到峰值，M6G濃度在6h時(shí)達(dá)到峰值。另有2名志愿者因rs2242480基因突變(CYP3A4)，其嗎啡峰值出現(xiàn)在72h，M3

21、G和M6G峰值也出現(xiàn)在72h，可待因的峰值出現(xiàn)在80h。結(jié)果表明，該2名志愿者可能為可待因慢代謝者(PM)，攝入的可待因在人體內(nèi)代謝緩慢，易造成藥物蓄積。同時(shí)指出，CYP2D6基因突變易造成超強(qiáng)代謝者(UM)，導(dǎo)致嗎啡過(guò)量而引起中毒，但本項(xiàng)研究尚未發(fā)現(xiàn)有超強(qiáng)代謝者。
　　小結(jié)
　　本課題創(chuàng)建了基于復(fù)合PCR和MALDI-TOF MS的中國(guó)漢族人群CYP基因座上50個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型方法，首次報(bào)道8個(gè)位點(diǎn)的分布頻率在中國(guó)漢

22、族人群和高加索人群中存在顯著性差異(p＜0.01)，2個(gè)位點(diǎn)的分布頻率和現(xiàn)存中國(guó)漢族人群分布頻率之間存在顯著性差異(p＜0.01)。該方法檢測(cè)結(jié)果可信且適用于高通量的基因分型研究，提高了法醫(yī)毒理學(xué)中毒藥物相關(guān)基因篩選的效能。同時(shí)本研究首次建立了唑吡坦及其代謝物、可待因及其代謝物的UPLC-MS/MS確證定量分析方法，并自主研發(fā)了唑吡坦分子印跡固相萃取柱用于唑吡坦的分離分析，申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利一項(xiàng)。本論文還建立了170種毒藥物的LC-MS/MS

23、分析篩選體系，為其他多種藥物代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析提供了技術(shù)儲(chǔ)備。所建方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，能夠有效地解決攝毒、涉藥案件，提高突發(fā)案（事）件的快速反應(yīng)能力和鑒定效能。
　　在國(guó)內(nèi)率先通過(guò)志愿者實(shí)驗(yàn)，考察了唑吡坦、可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):唑吡坦的氧化代謝主要是通過(guò)細(xì)胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。若發(fā)生CYP3A4*18的突變，則會(huì)增強(qiáng)CYP3A4酶的活性，從而引起該基因突變?nèi)巳簩?duì)唑

24、吡坦的代謝增強(qiáng)。若發(fā)生CYP2C19*2的突變，則會(huì)降低CYP2C19酶的活性，從而引起中國(guó)漢族人群對(duì)唑吡坦的弱代謝。可待因的代謝主要是通過(guò)CYP2D6和CYP3A4，若發(fā)生CYP2D6基因突變則易引起超強(qiáng)代謝類(lèi)型，若發(fā)生CYP3A4突變則易會(huì)引起可待因弱代謝型。
　　本研究首次報(bào)道了CYP基因多態(tài)性與唑吡坦及可待因代謝之間的關(guān)系，在國(guó)內(nèi)率先進(jìn)行了將藥物基因組學(xué)應(yīng)用于法醫(yī)毒理學(xué)的探索研究，該研究結(jié)果可用于解釋不同人群對(duì)唑吡坦及可待