人肝微粒體CYP2A6和CYP2C9基因多態(tài)性對(duì)其藥物代謝活性的影響.pdf

1、細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)又稱混合功能氧化酶和單加氧酶，是一類以血紅素為輔基的b族細(xì)胞色素的超家族蛋白酶，其中CYP2A6和CYP2C9不僅分別參與臨床約3％和15％藥物的代謝，還能代謝和/或活化多種前致癌物、前毒物及致突變劑。
　　目前發(fā)現(xiàn)多種藥物代謝酶含量和活性在個(gè)體間和種族間都呈現(xiàn)出顯著的差異性，從而在對(duì)臨床用藥、環(huán)境化合物和前致癌物的毒性作用的敏感性上表現(xiàn)出個(gè)體差異。通常CYP酶的基因多態(tài)

2、性可能是引起個(gè)體差異的主要原因之一。CYP2A6和CYP2C9基因具有高度的遺傳多態(tài)性，以往的相關(guān)研究多在重組酶體系和人體體內(nèi)展開，前者雖能較好的反映單一酶活性，但與人體內(nèi)環(huán)境相差較遠(yuǎn)，后者雖接近人體內(nèi)環(huán)境，但涉及藥物體內(nèi)處置的多個(gè)環(huán)節(jié)，不能單一反映代謝過程。綜合來說，人肝是人體最為接近的體外代謝平臺(tái)。
　　本研究擬以肝功能正常的人肝標(biāo)本為研究對(duì)象，考察基因多態(tài)性對(duì)CYP2A6和CYP2C9代謝探針?biāo)幬锵愣顾?coumarin，C

3、OH)和甲苯磺丁脲(tolbutamide，TOB)的影響，以期為臨床合理應(yīng)用經(jīng)CYP2A6和CYP2C9代謝的藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1 人肝標(biāo)本
　　收集正常人肝標(biāo)本108例，年齡20～75歲（中位數(shù)為47歲）。男性和女性分別為36例和72例，有吸煙史和飲酒史的分別為12例和96例，用藥史顯示近期均未用明顯影響CYP酶活性的藥物。本試驗(yàn)方案經(jīng)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者簽署知情同意書。
　　

4、2 CYP2A6和CYP2C9的基因分型
　　采用DNA提取試劑盒從肝組織中提取基因組DNA。用CYP2A6、CYP2C9引物擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的基因片段，通過測(cè)序確定受試者的基因型。
　　3 人肝微粒體的制備
　　采用差速離心法制備人肝微粒體，Bradford法測(cè)定肝微粒體蛋白含量。CYP2A6和CYP2C9的體外探針分別選擇香豆素和甲苯磺丁脲，并以探針?biāo)幬锏纳镛D(zhuǎn)化程度(TR)作為反應(yīng)速度。
　　4 探針?biāo)幬锛按?/p>

5、謝物濃度的測(cè)定
　　人肝微粒體孵育體系中加入探針?biāo)幬?、磷酸鹽緩沖液等，預(yù)孵育后加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，孵育后加入高氯酸終止反應(yīng)，渦旋、離心，取上清進(jìn)行分析測(cè)定。并進(jìn)行孵育條件的優(yōu)化，選擇最合適的孵育時(shí)間和微粒體蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)所用探針?biāo)幬锛捌浞跤w系中代謝物的濃度測(cè)定均選用HPLC法。結(jié)果表明，所建立的藥物測(cè)定方法專屬性高，精密度、回收率良好，RSD＜15％，均符合生物樣本的測(cè)定要求。
　　5 人肝酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定
　

6、　CYP2A6底物香豆素的濃度范圍為0.15625～20μM，CYP2C9底物甲苯磺丁脲的濃度范圍為31.25～2000μM。CYP2A6和CYP2C9孵育體系中蛋白濃度分別為0.3mg·ml-1和0.5mg·ml-1，孵育時(shí)間分別為30 min和60 min，分別測(cè)定105例人肝CYP2A6和108例人肝CYP2C9的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint。
　　6 統(tǒng)計(jì)方法
　　采用GraphPad Prism5.0軟件

7、計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)于非正態(tài)分布的，采取非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 CYP2A6基因型對(duì)人肝微粒體代謝香豆素的影響
　　1.1人肝微粒體代謝香豆素的酶動(dòng)力學(xué)
　　正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，人肝微粒體CYP2A6代謝香豆素的酶動(dòng)力參數(shù)呈非正態(tài)分布，因此本實(shí)驗(yàn)采用非參數(shù)檢驗(yàn)

8、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。105例人肝微粒體代謝香豆素的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint分別2.33(0.78～10.09)μM、354.4(3.7～1430.0)pmol·min-1·mg-1protein、144.5(1.2～544.7)μl.min-1·mg-1protein。Km、Vmax和CLint差異倍數(shù)分別為12.9、386.5和453.9倍。結(jié)果顯示，CYP2A6代謝香豆素的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint呈現(xiàn)出較大的個(gè)

9、體差異性。
　　1.2 CYP2A6*1B基因型與香豆素代謝
　　CYP2A6*1B的突變頻率為53.3％。CYP2A6代謝香豆素的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint在CYP2A6*1A/*1A、*1A/*1B和*1B/*1B三組中都無顯著的差異性。結(jié)果顯示，CYP2A6*1B突變對(duì)人肝CYP2A6的代謝活性無明顯影響。
　　1.3 CYP2A6*4基因型與香豆素代謝
　　105例樣本中基因型為CYP2A6*

10、1/*1和*1/*4的樣本分別有90和15例。CYP2A6*4的突變頻率為7.1％。CYP2A6*1/*1和*1/*4基因型人肝微粒體Km、Vmax和CLint分別為2.44(0.87～10.09)和1.18(0.78～7.88)μM，374.5(49.7～1430.0)和42.5(3.7～495.1)pmol·min-1·mg-1protein,147.4(27.4～544.7)和43.2(1.2～209.7)μl·min-1·mg-

11、1 protein，前者Km、Vmax和CLint均顯著高于后者(P＜0.05)。結(jié)果顯示，CYP2A6*4突變明顯降低人肝CYP2A6對(duì)香豆素的代謝活性。
　　1.4 CYP2A6*9基因型與香豆素代謝
　　CYP2A6*9的突變頻率為23.3％。CYP2A6*1/*1、*1/*9和*9/*9基因型人肝微粒體的Km分別為2.72(0.98～10.09)、2.09(0.87～6.18)和1.27(0.89～1.96)μM，前

12、者顯著高于后兩者(P＜0.05)。CYP2A6*9/*9基因型的Vmax為179.2(117.4～248.9)pmol.min-1·mg-1protein顯著低于*1/*1基因型417.2(49.7～1430.0)prnol·min-1·mg-1protein。結(jié)果顯示，CYP2A6*9突變明顯降低CYP2A6對(duì)香豆素的代謝活性。
　　2 CYP2C9基因型對(duì)人肝微粒體代謝甲苯磺丁脲的影響
　　2.1人肝微粒體代謝甲苯磺丁脲

13、的酶動(dòng)力學(xué)
　　正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，人肝微粒體CYP2C9代謝甲苯磺丁脲的酶動(dòng)力參數(shù)呈非正態(tài)分布，因此本實(shí)驗(yàn)采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。108例人肝微粒體代謝甲苯磺丁脲的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint分別230.4(101.2～555.3)μM、254.1(82.4-～454.8)pmol·min-1·mg-1protein、1.11(0.17～4.18)μl·min-1·mg-1protein。Km、Vmax和CLint

14、差異倍數(shù)分別為5.5、5.5和24.6倍。結(jié)果顯示，CYP2C9代謝甲苯磺丁脲的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint呈現(xiàn)出較大的個(gè)體差異性。
　　2.2 CYP2C9*3基因型與甲苯磺丁脲代謝
　　108例樣本中基因型為CYP2C9*1/*1、*1/*3的樣本分別有102和8例。CYP2C9*3的突變頻率為2.78％。CYP2C9*1/*1、*1/*3基因型人肝微粒體的Km、Vmmx和CLint分別為217.9(101.2

15、～555.3)和324.7(266.3～510.9)μM，257.1(83.8～454.8)和172.6(82.4～207.0)pmol·min-1.mg-1protein,1.18(0.17～4.18)和0.47(0.30～0.78)μl·min-1·mg-1protein，前者Km顯著低于后者，Vmax和CLint均顯著高于后者(P＜0.05)。結(jié)果顯示，CYP2C9*3突變明顯降低人肝CYP2C9對(duì)甲苯磺丁脲的代謝活性。