促血管生成素評(píng)估IVF患者子宮內(nèi)膜血管形成及內(nèi)膜容受性.pdf

1、目的:通過研究體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization embryotransfer，IVF-ET)患者預(yù)備周期胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜促血管生成素(angiopoietins，Angs)、子宮內(nèi)膜微血管密度（microvessel density，MVD）表達(dá)及相關(guān)性分析，進(jìn)一步闡明Ang-1、Ang-2評(píng)估子宮內(nèi)膜血管形成及內(nèi)膜容受性預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的價(jià)值。
　　方法:選擇2014年8月～2014年12月在河

2、北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科首次行IVF助孕治療患者。年齡為20～35歲，具有正常月經(jīng)周期，周期21～35天，不孕原因主要為輸卵管因素，新鮮周期移植2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎。于IVF預(yù)備周期胚胎植入窗口期獲取子宮內(nèi)膜，-80℃凍存樣本，部分組織用4％甲醛固定。分別用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)和免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistr

3、y）測(cè)定子宮內(nèi)膜中Ang-1、Ang-2含量，用免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)定子宮內(nèi)膜MVD。
　　應(yīng)用免疫組化檢測(cè):將子宮內(nèi)膜組織用4％甲醛固定后石蠟包埋，制備4μm厚連續(xù)組織切片。分別進(jìn)行HE和免疫組化染色。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。每張染色片隨機(jī)選取5個(gè)視野，進(jìn)行結(jié)果分析，顯微鏡觀察并拍照。
　　應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，分別取研究組及對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織加入Rezol1 ml置勻漿器內(nèi)充分勻漿，提取總RNA，取出0.5μl，進(jìn)

4、行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，繼而進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為605 bp的GAPDH作為內(nèi)參照。Ang-1和Ang-2PCR循環(huán)條件為:95℃10 min，1個(gè)循環(huán);95℃45 s，60℃45 s，72℃50s，35個(gè)循環(huán);72℃10 min，1個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，用VDS圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行照相和圖像分析。IOD值經(jīng)內(nèi)參照校正，將校正值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　控制性超促排卵:所有患者均采用黃體期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案，即排卵后

5、6-7天（黃體中期）給予醋酸亮丙瑞林（北京博恩特藥業(yè)有限公司）1.3mg，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后給予重組人促卵泡激素注射液150-225IU(默克雪蘭諾公司，意大利)，采用經(jīng)陰道超聲監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜變化和卵泡生長(zhǎng)情況，當(dāng)至少有2個(gè)卵泡直徑大于20mm時(shí)，當(dāng)晚注射艾澤（重組人絨促性素注射液，意大利）250μg，艾澤注射后37h左右取卵，適時(shí)加精，體外受精，于取卵后3d，移植優(yōu)質(zhì)胚胎2枚，移植后28d經(jīng)陰道B超見到孕囊為臨床妊娠。
　　所有數(shù)據(jù)

6、采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用(X)±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05即有顯著性差異;等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05即有顯著性差異。對(duì)相關(guān)的計(jì)量資料采用Person相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1、臨床妊娠組與未妊娠組一般情況比較
　　臨床妊娠組(n=12)與未妊娠組(n=13)比較，在年齡、不孕年限、不孕原因、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH及竇卵泡數(shù)方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

7、.05)。（見Table1）
　　2、臨床妊娠組和未妊娠組之間IVF-ET常規(guī)比較
　　兩組之間獲卵率、優(yōu)胚率、移植日內(nèi)膜、移植日E2及移植日P差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見Table2）
　　3、免疫組織化學(xué)檢測(cè)臨床妊娠組和未妊娠組預(yù)備周期胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜Ang-1、Ang-2及MVD表達(dá)
　　3.1 Ang-1在預(yù)備周期胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。臨床妊娠組

8、(n=12)，“-”表達(dá)1例，“+”表達(dá)2例，“++”表達(dá)5例，“+++”表達(dá)4例。未妊娠組(n=13)，“-”表達(dá)4例，“+”表達(dá)5例，“++”表達(dá)3例，“+++”表達(dá)1例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。（見Table3）
　　3.2 Ang2主要在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞表達(dá)。Ang-2在臨床妊娠組與未妊娠組均有表達(dá)，臨床妊娠組(n=13)，“-”表達(dá)2例，“+”表達(dá)3例，“++”表達(dá)5例，“+++”表達(dá)2例。未妊娠

9、組(n=13)，“-”表達(dá)3例，“+”表達(dá)6例，“++”表達(dá)2例，“+++”表達(dá)2例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.335)。（見Table4）
　　3.3以CD34特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)定MVD。胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜組織中微血管在腺體周圍基質(zhì)中表達(dá)豐富。妊娠組MVD（16.42±4.66）表達(dá)量高于未妊娠組（12.31±4.40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。（見Table5）
　　4、RT-PCR檢測(cè)臨床妊娠組和未

10、妊娠組預(yù)備周期胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜Ang-1 mRNA及Ang-2mRNA表達(dá)
　　4.1胚胎著床窗口期臨床妊娠組子宮內(nèi)膜Ang-1 mRNA的表達(dá)明顯高于未妊娠組，Ang-1mRNA在妊娠組的表達(dá)為0.72±0.35(n=12)，未妊娠組的表達(dá)為0.33±0.32(n=13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。（見Table6）
　　4.2 Ang-2mRNA在臨床妊娠組的表達(dá)為0.65±0.60(n=12)，未妊娠組

11、的表達(dá)為0.65±0.41(n=13)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.988)。（見Table6）5胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)水平與MVD相關(guān)性分析
　　5.1 IVF患者胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜Ang-1蛋白表達(dá)與MVD相關(guān)系數(shù)0.564，P=0.003，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（見Table7）
　　5.2 IVF患者胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜Ang-2蛋白表達(dá)與MVD相關(guān)系數(shù)0.273，P=0.187，差異無

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（見Table8）
　　結(jié)論:
　　1、Ang-1蛋白在預(yù)備周期胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。
　　2、Ang-1 mRNA可能為子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因之一，高表達(dá)的Ang-1 mRNA更利于胚胎植入，有較好的妊娠結(jié)局。IVF患者胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜Ang-1mRNA可能為預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的指標(biāo)之一。
　　3、Ang-2蛋白主要在預(yù)備周期胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞

13、及腺上皮細(xì)胞表達(dá)。
　　4、Ang-2 mRNA在臨床妊娠組與未妊娠組預(yù)備周期胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜表達(dá)無差異，不能預(yù)測(cè)IVF患者妊娠結(jié)局，但其在評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性中的作用機(jī)制及意義有待進(jìn)一步探索。
　　5、IVF患者預(yù)備周期胚胎著床窗口期臨床妊娠組子宮內(nèi)膜MVD明顯高于未妊娠組，子宮內(nèi)膜組織豐富的微血管更有利于胚胎植入，MVD可能為預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的指標(biāo)之一。
　　6、胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜Ang-1蛋白表達(dá)與MVD顯著