丙泊酚對體外培養(yǎng)發(fā)育期海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分原代大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)學(xué)觀察
　　目的:通過對新生24 h內(nèi)SD乳鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)，掌握大鼠海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法;利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元純度;觀察原代海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，測定細(xì)胞生長曲線。
　　方法:取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠，用75％乙醇消毒，斷頭，無菌條件下分層剪開皮膚和顱骨，暴露兩側(cè)大腦半球，彎鑷取出大腦，置于預(yù)冷的DMEM液中，迅速分離出兩側(cè)海馬組織，在解剖顯微鏡下去除血管和被

2、膜，移入溶有木瓜酶的DMEM中，置于培養(yǎng)箱(37℃，5％ CO2)中消化30 min。用玻璃吸管將組織塊移入加有10％血清的DMEM液中終止消化兩次，每次2 min。然后將組織塊移入加有血清的DMEM液中，用進(jìn)口槍頭輕輕吹打數(shù)次，靜置后取上清液，如此重復(fù)2次。取0.9 ml按臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，制成密度為1×106/ml的細(xì)胞懸液，種植于基膜包被的24孔培養(yǎng)板中，每孔加150μl，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4～6h后

3、在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞生長情況，全量換含有1％ N2、2％ B27的Neurobasal培養(yǎng)液。此后每2d半量換液，并在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長情況。神經(jīng)元培養(yǎng)7d后，4％ PFA固定，0.3％Triton透膜，10％ BSA封閉后滴加一抗β-Tubulin抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜，加2％BSA稀釋的Dylight488標(biāo)記的二抗，37℃孵育2h。10μg/ml的Hoechst33258復(fù)染細(xì)胞核，避光孵育20

4、 min。熒光顯微鏡下觀察。在高倍視野(×200)下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，換算為百分比，取均值作為神經(jīng)元純度。將細(xì)胞接種于96孔板，每隔兩天測吸光度值，共測8次得出生長曲線。
　　結(jié)果:1剛剛接種的細(xì)胞形態(tài)為圓形，體積小、透亮、呈懸浮狀態(tài)，單個均勻分布，培養(yǎng)4～6 h后細(xì)胞已貼壁，呈圓形或橢圓形，已有細(xì)胞出現(xiàn)突起，少量細(xì)胞呈梭形。接種24 h，細(xì)胞形態(tài)多呈梭形、三角形、椎體形，突起伸長，長短不一。接種48 h，細(xì)胞多出

5、現(xiàn)2～3個突起，且突起較長，扁平狀多邊形的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少。3d后細(xì)胞具有典型神經(jīng)元形態(tài)，細(xì)胞突起增多伸長。5d后神經(jīng)元開始形成神經(jīng)元群落，突起已經(jīng)形成比較稠密的纖維網(wǎng)絡(luò)。7～10d神經(jīng)元胞體最豐滿，具有明顯的光暈，突起相互交織成更加密集的網(wǎng)絡(luò)。14d后細(xì)胞聚集現(xiàn)象較為明顯，培養(yǎng)板上出現(xiàn)的細(xì)胞間空白區(qū)域明顯。之后神經(jīng)細(xì)胞逐漸退化，細(xì)胞邊緣光暈變淺變淡，突起逐漸退縮，部分細(xì)胞核具有明顯的固縮。2原代培養(yǎng)神經(jīng)元形態(tài)典型，突起連接成網(wǎng)，細(xì)

6、胞核染色清晰，β-TubulinⅢ陽性神經(jīng)元所占比例為(91.21±0.02)％，能夠滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)要求。3原代海馬神經(jīng)元生長曲線測定顯示，海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)條件下經(jīng)歷了生長潛伏期(2～4 d)，對數(shù)生長期(4～12 d)，后進(jìn)入生長平臺和衰退期，細(xì)胞生長處于停滯和衰退狀態(tài)。
　　結(jié)論:1原代SD新生乳鼠海馬神經(jīng)元，在培養(yǎng)10d后細(xì)胞形態(tài)逐漸成熟。在倒置相差顯微鏡下形態(tài)呈梭形、三角形、錐體形。2原代培養(yǎng)的神經(jīng)元免疫熒光染色為β-

7、tublinⅢ陽性細(xì)胞，其純度為(91.21±0.02)％。3原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)經(jīng)歷了一個生長潛伏期、對數(shù)生長期、生長平臺期和衰退期。
　　第二部分丙泊酚對發(fā)育期海馬神經(jīng)元活力和凋亡的影響
　　目的:通過給予不同濃度的丙泊酚培養(yǎng)神經(jīng)元不同的時間后，采用MTT法測定丙泊酚對發(fā)育期的海馬神經(jīng)元的活性影響;采用流式細(xì)胞技術(shù)測定不同濃度的丙泊酚培養(yǎng)24 h對海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和周期的影響;采用Hoechst33258染色觀察神經(jīng)元

8、的凋亡情況。
　　方法:取原代培養(yǎng)4～5 d的海馬神經(jīng)元，分別加入10μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml不同濃度的丙泊酚，作用12、24、48、72 h后，測量MTT值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)原代培養(yǎng)基作為空白對照組。細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）。根據(jù)MTT所得結(jié)果，在6孔板培養(yǎng)海馬神經(jīng)元4～5 d，加入40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml不同濃度丙泊酚，繼續(xù)培養(yǎng)24

9、h，收集細(xì)胞標(biāo)本，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元的凋亡和周期;Hoechst33258染色測定凋亡，細(xì)胞培養(yǎng)同流式檢測，其分組同MTT檢測各組。
　　結(jié)果:1MTT法檢測細(xì)胞活力結(jié)果表明，丙泊酚對海馬神經(jīng)元活力的影響具有濃度和時間的交互作用(F=11.116，P＜0.01)。當(dāng)給藥濃度相同時，丙泊酚作用海馬神經(jīng)元不同的時間，對其活力的影響具有顯著性差異(F=18.565，P＜0.01)，其中丙泊酚在處理12h和48 h后無顯著性差

10、異。當(dāng)作用時間相同時，不同濃度的丙泊酚對細(xì)胞活力的影響具有顯著性差異(F=889.074，P＜0.01)，與對照組相比10μg/ml丙泊酚在各個作用時間上均無顯著性差異。2流式細(xì)胞技術(shù)檢測凋亡率表明，各濃度丙泊酚處理海馬神經(jīng)元24 h對其凋亡率的影響具有顯著性差異(F=76.577，P＜0.01)。各濃度丙泊酚與對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)差異，且隨濃度的增加神經(jīng)元凋亡率增加。流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明，不同濃度丙泊酚作用于海馬神經(jīng)元2

11、4 h對細(xì)胞周期的G0/G1期和S期的影響具有顯著性差異(F=138.456, P＜0.01;F=114.158，P＜0.01)，40、60、80μg/ml濃度均有統(tǒng)計學(xué)差異。隨著丙泊酚作用濃度的增加，G0/G1期的細(xì)胞比率逐漸下降，S期的細(xì)胞比率逐漸增高，G2/M期細(xì)胞比率在所有組別中有統(tǒng)計學(xué)差異（F=14.131，P＜0.01），40、60μg/ml與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。3 Hoechst33258熒光染色細(xì)胞核表明隨著丙泊酚濃

12、度的增加，細(xì)胞核變形，呈折縫樣或呈波紋狀的細(xì)胞核逐漸增多，部分染色質(zhì)凝聚、邊緣化，100μg/ml時細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞核甚至裂解成碎塊。
　　結(jié)論:丙泊酚對發(fā)育期海馬神經(jīng)元活力具有抑制作用且呈時間和濃度依賴性，兩者有交互性。不同濃度丙泊酚對發(fā)育期海馬神經(jīng)元的凋亡率的影響顯著，且隨濃度的增加而增加，而且可促進(jìn)發(fā)育期海馬神經(jīng)元由G0/G1期進(jìn)入S期，但不能進(jìn)入G2/M期，細(xì)胞增殖停滯于S期。
　　第三部分 Rho信號通路在丙泊

13、酚致發(fā)育期海馬神經(jīng)元毒性中的作用
　　目的:采用RT-PCR技術(shù)檢測Rho信號通路在丙泊酚神經(jīng)毒性中韻作用。
　　方法:取原代培養(yǎng)4～5 d海馬神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為對照組、80μg/ml丙泊酚處理組、80μg/ml丙泊酚加10μM Y27632混合組、10μM Y27632組，即C組、P組、P+Y組和Y組，培養(yǎng)時間為24 h。利用RT-PCR技術(shù)分析各實(shí)驗(yàn)組RhoA、Rac1、 CDC42和PAK1表達(dá)的改變。
　　結(jié)

14、果:RT-PCR分析顯示:P組與C組相比RhoA的表達(dá)明顯增高（P＜0.01），RAC1、PAK1表達(dá)明顯降低（P＜0.01），CDC42降低（P＜0.05）;P+Y組與P組相比RhoA的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），CDC42表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，RAC1、PAK1的表達(dá)增高，但無統(tǒng)計學(xué)差異;P+Y組與Y組相比RhoA的表達(dá)明顯升高（P＜0.01），RAC1、CDC42、PAK1表達(dá)明顯降低(P＜0.01);Y組與C組相比，R