丙泊酚對(duì)發(fā)育期大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　丙泊酚（2，6-雙異丙基苯酚）是目前臨床上廣泛應(yīng)用的靜脈麻醉藥物，而且其廣泛應(yīng)用于兒科（包括新生兒）麻醉、鎮(zhèn)靜等方面。在臨床工作中，圍術(shù)期應(yīng)用丙泊酚鎮(zhèn)靜或麻醉的患兒常出現(xiàn)譫妄等神經(jīng)行為異常的問(wèn)題。因?yàn)楸捶赢a(chǎn)生麻醉效應(yīng)的主要機(jī)制是激動(dòng)中樞抑制性γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）受體和抑制興奮性N-甲基-D-天（門(mén)）冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體，而GAB

2、A和NMDA介導(dǎo)的神經(jīng)元活性對(duì)哺乳動(dòng)物的腦發(fā)育而言是必不可缺的，所以，應(yīng)用于小兒鎮(zhèn)靜或麻醉的GABA激動(dòng)劑極可能會(huì)干擾神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，這一觀點(diǎn)已得到了國(guó)內(nèi)外眾多實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，但目前，還有某些關(guān)鍵機(jī)制尚未被發(fā)現(xiàn)，比如大腦中數(shù)量較多且與神經(jīng)元突觸聯(lián)系最緊密的星形膠質(zhì)細(xì)胞（主要的膠質(zhì)細(xì)胞種類(lèi)）中也存在大量的GABA受體，而且其在哺乳動(dòng)物腦發(fā)育和認(rèn)知方面有重要意義，但關(guān)于全麻藥對(duì)其作用機(jī)制的研究卻十分欠缺。
　　小分子R

3、NA（microRNA或miRNAs）是一類(lèi)重要的內(nèi)源性單鏈非編碼RNAs，其以特異性序列結(jié)合的方式下調(diào)靶基因活性或降解靶基因，從而調(diào)控基因的表達(dá)。近年來(lái)，大量研究證實(shí)miRNAs是動(dòng)物早期胚胎、腦及神經(jīng)發(fā)育的重要調(diào)控因子，提示miRNAs可能調(diào)控全麻藥物對(duì)發(fā)育大腦的影響。但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)從miRNAs的水平探究全麻藥物對(duì)發(fā)育大腦影響機(jī)制的報(bào)道，因此有必要深入探究miRNAs在未成熟神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)和功能研究，為靶向干預(yù)圍術(shù)期患兒認(rèn)知功能損

4、傷提供理論基礎(chǔ)。本課題通過(guò)miRNAs在丙泊酚作用和正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的差異表達(dá)分析和特定miRNAs作用機(jī)制的闡釋?zhuān)M(jìn)一步加強(qiáng)全身麻醉藥對(duì)發(fā)育大腦影響的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　方法：
　　一、丙泊酚可引起發(fā)育期大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡
　　（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　SPF級(jí)7日齡的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體重10-15g，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　?。ǘ?shí)驗(yàn)分

5、組
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為四組(n=20):A組:脂肪乳組（腹腔注射等體積）;B組:腹腔單次注射丙泊酚30 mg/kg，1h后處死;C組:腹腔單次注射丙泊酚30 mg/kg，8h后處死;D組:腹腔單次注射丙泊酚30 mg/kg，24 h后處死。另外，從每組剩余動(dòng)物中隨機(jī)選擇5只大鼠行動(dòng)脈血?dú)夥治觥?br>　?。ㄈ╇p重免疫熒光染色
　　分別在用藥1、8、24 h后用10％水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠，取材后制備冰

6、凍切片。然后，進(jìn)行GFAP和Cleaved caspase-3的免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察染色效果。
　　（四）制備電子顯微鏡標(biāo)本
　　將給藥后的大鼠用10％水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射，灌注固定成功后，斷頭取腦組織，在冰上剝離海馬。獲取的海馬組織經(jīng)固定、水洗、脫水、包埋、聚合及干燥后利用電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　?。ㄎ澹┙y(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)

7、據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。各組間結(jié)果比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA followed byBonferroni test)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　二、丙泊酚對(duì)發(fā)育大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞miRNAs基因表達(dá)譜的影響
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　SPF級(jí)7日齡的新生SD大鼠，體重10-15 g，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　?。ǘ?shí)驗(yàn)分組
　

8、　將96孔板內(nèi)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為6組，分別是正常細(xì)胞組、丙泊酚P1、2、3、4組。 P1-4組終濃度分別為0.9、5、10、20、50μg/ml。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔100 ul，37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)1h和48 h后收集，正常細(xì)胞可培養(yǎng)24 h后直接收集。
　　（三）星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)鑒定
　　選取大鼠海馬組織。經(jīng)剪碎→消化→鏡檢→中止→過(guò)濾→離心→漂洗→原代培養(yǎng)→傳代純

9、化后，調(diào)整細(xì)胞密度（0.5～1.0×103個(gè)/cm2）接種于預(yù)處理（多聚-L-賴氨酸）的培養(yǎng)瓶或96孔培養(yǎng)板內(nèi)（內(nèi)置1 cm的蓋玻片）。其中部分細(xì)胞行GFAP免疫染色，
　?。ㄋ模㎝TT法檢測(cè)細(xì)胞活性
　　在各組的細(xì)胞中加入MTT溶液，置培養(yǎng)箱中孵育4h后離心，小心吸棄上清。每孔再加入DMSO，然后在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算平均值。
　?。ㄎ澹┨崛】俁NA及質(zhì)量評(píng)價(jià)
　　在傳

10、代細(xì)胞中加入含有0.9μg/ml和10μg/ml丙泊酚的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，48 h和1h后收集細(xì)胞（正常細(xì)胞可培養(yǎng)24 h后直接收集）。加入Trizol液，反復(fù)抽吸均勻，在裝有裂解物的離心管中加入氯仿振蕩混勻，室溫下靜置3 min。離心后小心吸取上清液，加入異丙醇振蕩，室溫下靜置后離心，吸棄上清液。在獲取的RNA沉淀中加入70％的乙醇清洗后吸棄上清。最后，用Agilent2100生物分析儀檢測(cè)RNA純度，毛細(xì)管凝膠電泳法檢測(cè)RNA

11、完整性。
　?。┬酒瑨呙?br>　　微陣列實(shí)驗(yàn)由LC Sciences公司進(jìn)行。
　?。ㄆ撸┬酒Y(jié)果分析及驗(yàn)證
　　對(duì)芯片掃描結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和深度數(shù)據(jù)分析后獲得顯著性差異表達(dá)miRNAs列表，然后，分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、GO、KEGG分析以及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖構(gòu)建。最后，采用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)前期獲得的miRNAs差異表達(dá)譜進(jìn)行體外定量驗(yàn)證。
　　（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS16

12、.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。各組間比較進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA followed by Bonferronitest)，p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。芯片的數(shù)據(jù)分析將p-value設(shè)置為0.1，每組芯片設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù)。
　　三、 Rno-miR-665通過(guò)調(diào)控Bcl2l1抑制丙泊酚引起的發(fā)育期星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡
　　（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　SPF級(jí)7日齡的

13、新生Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體重10-15g，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　（二）星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）鑒定
　　同論文二相應(yīng)部分。
　　結(jié)果：
　　一、丙泊酚可引起發(fā)育期大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡
　?。ㄒ唬┭?dú)夥治鼋Y(jié)果
　　各組大鼠的血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示pH、PaO2、 PaCO2、HCO3-、BE、SaO2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.0

14、5，n=5)。
　?。ǘ╇p重免疫熒光染色結(jié)果
　　新生7天大鼠腹腔單次注射丙泊酚(30 mg/kg)8 h和24 h后，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的GFAP熒光強(qiáng)度增大，Cleaved caspase-3表達(dá)增多，且24 h增多最為明顯;在丙泊酚單次給藥24 h后，GFAP/Cleaved caspase-3雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多(#p＜0.05,##p＜0.01vs.propofol1h)(n=15)。
　　（三）電鏡結(jié)果

15、r>　　新生7天大鼠單次腹腔注射丙泊酚30 mg/kg1 h、8h、24 h后海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了經(jīng)典的凋亡性改變。丙泊酚30 mg/kg腹腔給藥1h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞核膜尚完整，異染色質(zhì)少量邊集于核膜下，細(xì)胞器濃縮聚集。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，核膜多處溶解直至完全破裂，異染色質(zhì)濃縮邊集逐漸明顯，線粒體基質(zhì)密度增高。
　　二、丙泊酚對(duì)發(fā)育大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞miRNAs基因表達(dá)譜的影響
　?。ㄒ唬╇x體細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定<

16、br>　　離體海馬區(qū)星性膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成功。同一視野下，免疫雙標(biāo)的細(xì)胞純度＞95％可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　?。ǘ㎝TT檢測(cè)不同條件下丙泊酚對(duì)發(fā)育星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制作用
　　丙泊酚10、20、50μg/ml作用1h，丙泊酚0.9、5、10、20、50μg/ml作用48 h后，細(xì)胞活性明顯下降(**p＜0.01 vs.control group)。
　　結(jié)論：
　　1.新生7天大鼠腹腔單次注射丙泊酚30mg/kg1

17、h，8h和24 h可顯著增加海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率，提示丙泊酚可干擾神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育成熟。
　　2.通過(guò)對(duì)丙泊酚作用后miRNAs微流體芯片的深入分析，證實(shí)嚙齒類(lèi)動(dòng)物發(fā)育大腦多個(gè)顯著性變化的miRNAs與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)，而且，這些miRNAs所對(duì)應(yīng)的靶基因涉及到多個(gè)凋亡性通路的激活。因?yàn)轭A(yù)測(cè)靶基因含有Notch1和Bcl2l1(即Bcl-xl)的rno-miR-665在用藥后表達(dá)量顯著上升，這二者恰恰是凋亡抑制基因，所以選