雙酚A對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、雙酚A(bisPhenol A,BPA)是一種具有代表性的內(nèi)分泌干擾物,具有弱雌激素活性,廣泛用于食品和飲料的包裝材料碳酸聚酯、環(huán)氧樹(shù)脂、牙齒填充劑及相關(guān)產(chǎn)品的制造。目前,BPA對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響越來(lái)越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)BPA不僅可影響腦形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育,還可影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)以及神經(jīng)行為的發(fā)育。樹(shù)突發(fā)育是腦發(fā)育的重要過(guò)程,其結(jié)構(gòu)和特性決定突觸信息的傳遞功效。發(fā)育早期樹(shù)突分支的生長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)變化迅速,參與突觸發(fā)生、樹(shù)突分支形成,以及樹(shù)突棘

2、的發(fā)育。樹(shù)突分支過(guò)度生長(zhǎng)可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能異常。內(nèi)源性雌激素影響樹(shù)突發(fā)育和突觸發(fā)生,因此推測(cè)具有雌激素活性的BPA也可能會(huì)影響樹(shù)突的發(fā)育。谷氨酸NMDA受體在腦內(nèi)廣泛分布,并且與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)。有研究表明,NMDA受體參與神經(jīng)回路的形成和學(xué)習(xí)記憶過(guò)程,可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活,軸突和樹(shù)突的結(jié)構(gòu)發(fā)育以及突觸的可塑性等,為所有興奮性突觸的突觸后必需組份。而雌激素影響樹(shù)突發(fā)育與NMDA受體有關(guān)。鑒于NMDA受體在樹(shù)突發(fā)育中的重要作用

3、,本研究通過(guò)BPA染毒體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,觀察BPA急性和長(zhǎng)時(shí)暴露對(duì)樹(shù)突形態(tài)發(fā)育、NMDA受體亞基表達(dá)和磷酸化、以及雌激素受體β(EstrogenRecePtor beta,ERβ)表達(dá)的影響,以確定發(fā)育期BPA暴露是否改變樹(shù)突形態(tài)發(fā)生,并影響神經(jīng)NNMDA受體和雌激素受體的表達(dá),探討B(tài)PA影響神經(jīng)元樹(shù)突形態(tài)發(fā)育是否與NMDA受體相關(guān),雌激素受體是否參與了這一過(guò)程,為探索BPA影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:采用腺

4、病毒感染體外培養(yǎng)第5天(5 DIV)的海馬神經(jīng)元,使其表達(dá)綠熒光,通過(guò)活細(xì)胞成像觀測(cè)BPA染毒對(duì)海馬神經(jīng)元樹(shù)突形態(tài)動(dòng)力學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)分5個(gè)組:對(duì)照組(DMSO),BPA各劑量組(濃度分別為1、10、100、1000 nM)。BPA急性暴露時(shí)間為0.5 h,慢性暴露時(shí)間為24 h。染毒后,在熒光顯微鏡下對(duì)神經(jīng)元(7 DIV)進(jìn)行活細(xì)胞成像,每2 min拍攝一張圖片,共11張1組,動(dòng)態(tài)顯現(xiàn)神經(jīng)元樹(shù)突的生長(zhǎng)。采用Image-Pro Plus分析

5、圖像,測(cè)定樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng)性(μm/20 min)、樹(shù)突絲密度以及樹(shù)突分支總長(zhǎng)度。用10μM雌激素受體阻斷劑ICI182,780預(yù)處理海馬培養(yǎng)物0.5 h,然后再進(jìn)行BPA染毒,以分析BPA對(duì)樹(shù)突形態(tài)發(fā)育的影響時(shí)否通過(guò)雌激素受體進(jìn)行。通過(guò)BPA和10 nM E2的共同暴露,分析BPA與雌激素對(duì)樹(shù)突發(fā)育的共同作用。
　　 為了進(jìn)一步分析BPA影響樹(shù)突發(fā)育的機(jī)制,采用細(xì)胞免疫染色法,用兔來(lái)源多克隆NR1、NR2B、P-NR2B(Phos

6、Phorylated NR2B)和ERβ抗體檢測(cè)了NMDA受體NR1、NR2B、磷酸化NR2B亞基以及ERβ蛋白的表達(dá),并經(jīng)Image-Pro Plus分析圖像,測(cè)定各組細(xì)胞的光密度值。
　　 結(jié)果:1.BPA(10～1000 nM)急性暴露0.5 h快速增加樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng)性和密度(P<0.05,P<0.01或P<0.001),該作用可以被雌激素受體阻斷劑抑制(P<0.001)；但如果BPA與E2(10 nM)共同給藥,BPA或E

7、2單獨(dú)給藥誘導(dǎo)的樹(shù)突運(yùn)動(dòng)性和密度的增加被抑制。BPA(10、100 nM)長(zhǎng)時(shí)暴露24 h顯著增加樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng)性和密度以及樹(shù)突分支總長(zhǎng)度(P<0.001),該作用也可被雌激素受體阻斷劑抑制(P<0.05)；BPA與E2(10 nM)共同給藥,BPA或E2單獨(dú)給藥表現(xiàn)的增強(qiáng)作用被抑制(P<0.05)。
　　 2.BPA(10～1000 nM)急性暴露0.5 h,沒(méi)有改變NR1、NR2B的表達(dá),但卻劑量依賴性地上調(diào)了磷酸化NMDA受

8、體2B亞基(P-NR2B)的表達(dá)(P<0.05或P<0.001),這種上調(diào)作用可被雌激素受體阻斷劑抑制(P<0.01)。E2(10 nM)增加磷酸化NR2B的表達(dá),如果BPA與E2共同給藥,BPA或E2單獨(dú)給藥誘導(dǎo)的磷酸化NR2B表達(dá)上調(diào)被抑制(P<0.001)。BPA(100、1000 nM)暴露24 h顯著下調(diào)NR1、NR2B亞基的表達(dá)(P<0.001),該作用不受雌激素受體阻斷劑的影響；E2(10 nM)上調(diào)NR1、NR2B亞基的

9、表達(dá),如果BPA與E2共同給藥,E2單獨(dú)作用誘導(dǎo)NR1、NR2亞基表達(dá)的增加受到抑制。
　　 3.BPA(10～1000 nM)急性暴露0.5 h沒(méi)有引起ERβ蛋白表達(dá)的改變,而長(zhǎng)時(shí)暴露24 h可以上調(diào)ERβ蛋白的表達(dá)(P<0.001),雌激素受體阻斷劑可以抑制該作用(P<0.01)；BPA與E2共同給藥與BPA或E2單獨(dú)給藥對(duì)ERβ表達(dá)的影響無(wú)明顯差異,均可誘導(dǎo)ERβ表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論:BPA急性暴露可以快速增加體

10、外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng)性和密度,促進(jìn)NMDA受體2B亞基的磷酸化,但不改變海馬神經(jīng)元NR1,NR2B亞基和ERβ蛋白的表達(dá)。雌激素受體可能參與了BPA這些作用,由于核內(nèi)雌激素受體介導(dǎo)的效應(yīng)產(chǎn)生作用較慢,推測(cè)BPA快速作用可能通過(guò)膜雌激素受體進(jìn)行。
　　 BPA慢性暴露增加樹(shù)突絲運(yùn)動(dòng)性和密度,以及樹(shù)突分支總長(zhǎng)度,促進(jìn)ERβ蛋白表達(dá),卻下調(diào)NR1,NR2B亞基的表達(dá)。雌激素受體可能參與了BPA增加樹(shù)突絲運(yùn)動(dòng)性和密度、樹(shù)突分支總

11、長(zhǎng)度,以及上調(diào)ERβ蛋白表達(dá)的作用,而B(niǎo)PA對(duì)NR1、NR2B表達(dá)的影響可能通過(guò)其它途徑進(jìn)行。
　　 與E2相似,無(wú)論急性或慢性暴露,BPA都可增加樹(shù)突絲運(yùn)動(dòng)性和密度以及磷酸化NR2B的表達(dá)；而B(niǎo)PA與E2共同暴露時(shí),BPA或E2單獨(dú)給藥對(duì)樹(shù)突絲運(yùn)動(dòng)性和密度以及磷酸化NR2B表達(dá)的增加作用被抑制,二者表現(xiàn)出相互拮抗作用。
　　 綜上所述,BPA快速作用影響樹(shù)突形態(tài)發(fā)育及NMDA受體的磷酸化活性,該作用可能通過(guò)膜相關(guān)雌激素