丙泊酚及右美托咪定對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 原代乳鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定
　　目的:1.培養(yǎng)新生SD乳鼠海馬神經(jīng)元，掌握大鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù);2.觀察不同階段的原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點(diǎn);3.利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元純度。
　　方法:取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠，用碘酊和75％乙醇消毒，剪斷頭，分層剪開(kāi)皮膚和顱骨，用彎鑷取出大腦，置于預(yù)冷的DMEM液中，快速剝離出兩側(cè)海馬組織，在解剖

2、顯微鏡下去除海馬的血管和被膜，把海馬移入含有木瓜酶的DMEM中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中消化30 min。用吸管將組織塊移入含有10％血清的DMEM液中終止消化2min。然后把組織塊移入含有血清的DMEM液中，用維納斯剪剪碎，用槍頭輕輕吹打三到五次，然后過(guò)200目細(xì)胞篩。取0.9 ml按臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，制成1×106/ml密度的細(xì)胞懸液，種植于Matrigel基膜包被的24孔培養(yǎng)板中，每孔加500μl，置于37℃，5％

3、CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6h后全量換無(wú)血清Neurobasal培養(yǎng)基。第48 h時(shí)加入終濃度為10μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。每2天半量換液，并在顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)情況。神經(jīng)元培養(yǎng)6d后，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù)，用不同的熒光標(biāo)記分別顯示神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察，拍照。隨機(jī)選取3個(gè)孔，在高倍視野(10×20倍)下隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及所有細(xì)胞核的數(shù)目，計(jì)算神經(jīng)元所占的百分比，

4、取均值作為每孔神經(jīng)元純度。
　　結(jié)果:1.體外培養(yǎng)的原代SD乳鼠海馬神經(jīng)元，形態(tài)典型，突起連接成網(wǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好;2.體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞核染色清晰，海馬神經(jīng)元純度為(94.81±1.90)％，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.81)。
　　結(jié)論:體外培養(yǎng)的原代SD新生乳鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)典型，純度在90％以上，能夠滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)要求。
　　第二部分 丙泊酚及右美托咪定對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元突起及突觸影響
　　目

5、的:探討丙泊酚及右美托咪定是否會(huì)對(duì)原代培養(yǎng)的發(fā)育期SD乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸的發(fā)育產(chǎn)生影響。
　　方法:取原代培養(yǎng)第6d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組（C組）、丙泊酚溶劑對(duì)照組（F組）、丙泊酚組（P組）、右美托咪定組（D組）、丙泊酚加右美托咪定組(PD組)。于培養(yǎng)第6天， P組加入丙泊酚，使其終濃度為100μmol/L;F組加入等體積的丙泊酚溶劑;D組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定，使其終濃度為100 nmol/L，PD組

6、加入右美托咪定和丙泊酚，使其終濃度分別為100 nmol/L和100μmol/L;C組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)8h后，為各組神經(jīng)元全量換液，并用PBS清洗2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，隨機(jī)選取視野為神經(jīng)元拍照。所得照片用Motic Med6.0軟件處理，使用其測(cè)量長(zhǎng)度工具測(cè)量視野內(nèi)軸突和樹(shù)突的總長(zhǎng)度，計(jì)數(shù)該視野神經(jīng)元總數(shù)，以該視野神經(jīng)元平均突起總長(zhǎng)度作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。用免疫熒光化學(xué)法測(cè)定各組神經(jīng)元突觸素的含量，采集突觸素?zé)晒鈭D像，用

7、Image-Pro Plus6.0軟件分析各組突觸素的平均熒光密度(MOD，mean optical density)。
　　結(jié)果:1.神經(jīng)元平均突起總長(zhǎng)度:P組及PD組與C組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); PD組與P組比較，數(shù)值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);F組及D組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.突觸素的平均熒光密度值(MOD):P組及PD組與C組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

8、＜0.05);PD組與P組比較，數(shù)值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;F組及D組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1.丙泊酚影響原代培養(yǎng)的乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸的發(fā)育;2.右美托咪定減少丙泊酚對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育的影響。
　　第三部分 丙泊酚及右美托咪定對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能機(jī)制
　　目的:探討丙泊酚及右美托咪定對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能分子機(jī)制。
　　方法:取原代培

9、養(yǎng)第6d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組（C組）、丙泊酚溶劑對(duì)照組（F組）、丙泊酚組（P組）、右美托咪定組（D組）、丙泊酚加右美托咪定組(PD組)、育亨賓組（Y組）。于培養(yǎng)第5天，P組加入丙泊酚，使其終濃度為100μmol/L;F組加入等體積的丙泊酚溶劑;D組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定，使其終濃度為100nmol/L，PD組加入右美托咪定和丙泊酚，使其終濃度分別為100 nmol/L和100μmol/L;Y組先加入育亨賓，使其終

10、濃度為2μmol/L，再加入右美托咪定和丙泊酚，終濃度同PD組;C組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)8h后，為各組神經(jīng)元全量換液，并用PBS清洗2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，收集每組細(xì)胞，利用Western Blot技術(shù)分析各組腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF，brain-derivedneurotrophic factor)及其特異性受體TrkB和坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（CRMP-2，collapsin resp

11、onse mediator protein-2）表達(dá)的改變。利用GelImage Analysis V2.02軟件分析各條帶的灰度值，BDNF，TrkB和CRMP-2蛋白的相對(duì)量分別以BDNF，TrkB和CRMP-2條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示。
　　結(jié)果:1.BDNF: P組及PD組與C組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;PD組與P組比較，數(shù)值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

12、;Y組與P組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);F組及D組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.TrkB:P組、PD組及D組與C組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PD組及D組與P組比較，數(shù)值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;Y組與P組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);F組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.CRMP-2:P組及PD組與C組比較，數(shù)值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、(P＜0.05);與P組比較，PD組、Y組數(shù)值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);F組及D組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1.丙泊酚減少體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元BDNF，TrkB和CRMP-2的表達(dá)可能是丙泊酚影響海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育的分子機(jī)制之一;2.右美托咪定使丙泊酚孵育的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中BDNF，TrkB和CRMP-2的表達(dá)增加，可能是右美托咪定能減少丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育影響的可能分