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文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述:
第一部分 原代乳鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定
目的:1.培養(yǎng)新生SD乳鼠海馬神經(jīng)元,掌握大鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù);2.觀察不同階段的原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點(diǎn);3.利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元純度。
方法:取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠,用碘酊和75%乙醇消毒,剪斷頭,分層剪開(kāi)皮膚和顱骨,用彎鑷取出大腦,置于預(yù)冷的DMEM液中,快速剝離出兩側(cè)海馬組織,在解剖
2、顯微鏡下去除海馬的血管和被膜,把海馬移入含有木瓜酶的DMEM中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中消化30 min。用吸管將組織塊移入含有10%血清的DMEM液中終止消化2min。然后把組織塊移入含有血清的DMEM液中,用維納斯剪剪碎,用槍頭輕輕吹打三到五次,然后過(guò)200目細(xì)胞篩。取0.9 ml按臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),制成1×106/ml密度的細(xì)胞懸液,種植于Matrigel基膜包被的24孔培養(yǎng)板中,每孔加500μl,置于37℃,5%
3、CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6h后全量換無(wú)血清Neurobasal培養(yǎng)基。第48 h時(shí)加入終濃度為10μmol/L的阿糖胞苷,以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。每2天半量換液,并在顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)情況。神經(jīng)元培養(yǎng)6d后,應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù),用不同的熒光標(biāo)記分別顯示神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察,拍照。隨機(jī)選取3個(gè)孔,在高倍視野(10×20倍)下隨機(jī)選取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及所有細(xì)胞核的數(shù)目,計(jì)算神經(jīng)元所占的百分比,
4、取均值作為每孔神經(jīng)元純度。
結(jié)果:1.體外培養(yǎng)的原代SD乳鼠海馬神經(jīng)元,形態(tài)典型,突起連接成網(wǎng),生長(zhǎng)狀態(tài)良好;2.體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞核染色清晰,海馬神經(jīng)元純度為(94.81±1.90)%,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.81)。
結(jié)論:體外培養(yǎng)的原代SD新生乳鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)典型,純度在90%以上,能夠滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)要求。
第二部分 丙泊酚及右美托咪定對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元突起及突觸影響
目
5、的:探討丙泊酚及右美托咪定是否會(huì)對(duì)原代培養(yǎng)的發(fā)育期SD乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸的發(fā)育產(chǎn)生影響。
方法:取原代培養(yǎng)第6d的海馬神經(jīng)元,隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(C組)、丙泊酚溶劑對(duì)照組(F組)、丙泊酚組(P組)、右美托咪定組(D組)、丙泊酚加右美托咪定組(PD組)。于培養(yǎng)第6天, P組加入丙泊酚,使其終濃度為100μmol/L;F組加入等體積的丙泊酚溶劑;D組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定,使其終濃度為100 nmol/L,PD組
6、加入右美托咪定和丙泊酚,使其終濃度分別為100 nmol/L和100μmol/L;C組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)8h后,為各組神經(jīng)元全量換液,并用PBS清洗2次,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,隨機(jī)選取視野為神經(jīng)元拍照。所得照片用Motic Med6.0軟件處理,使用其測(cè)量長(zhǎng)度工具測(cè)量視野內(nèi)軸突和樹(shù)突的總長(zhǎng)度,計(jì)數(shù)該視野神經(jīng)元總數(shù),以該視野神經(jīng)元平均突起總長(zhǎng)度作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。用免疫熒光化學(xué)法測(cè)定各組神經(jīng)元突觸素的含量,采集突觸素?zé)晒鈭D像,用
7、Image-Pro Plus6.0軟件分析各組突觸素的平均熒光密度(MOD,mean optical density)。
結(jié)果:1.神經(jīng)元平均突起總長(zhǎng)度:P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); PD組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);F組及D組與C組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.突觸素的平均熒光密度值(MOD):P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
8、<0.05);PD組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);F組及D組與C組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:1.丙泊酚影響原代培養(yǎng)的乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸的發(fā)育;2.右美托咪定減少丙泊酚對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育的影響。
第三部分 丙泊酚及右美托咪定對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能機(jī)制
目的:探討丙泊酚及右美托咪定對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元影響的可能分子機(jī)制。
方法:取原代培
9、養(yǎng)第6d的海馬神經(jīng)元,隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組(C組)、丙泊酚溶劑對(duì)照組(F組)、丙泊酚組(P組)、右美托咪定組(D組)、丙泊酚加右美托咪定組(PD組)、育亨賓組(Y組)。于培養(yǎng)第5天,P組加入丙泊酚,使其終濃度為100μmol/L;F組加入等體積的丙泊酚溶劑;D組加入生理鹽水稀釋的右美托咪定,使其終濃度為100nmol/L,PD組加入右美托咪定和丙泊酚,使其終濃度分別為100 nmol/L和100μmol/L;Y組先加入育亨賓,使其終
10、濃度為2μmol/L,再加入右美托咪定和丙泊酚,終濃度同PD組;C組加入等體積的生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)8h后,為各組神經(jīng)元全量換液,并用PBS清洗2次,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗兩次,收集每組細(xì)胞,利用Western Blot技術(shù)分析各組腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF,brain-derivedneurotrophic factor)及其特異性受體TrkB和坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(CRMP-2,collapsin resp
11、onse mediator protein-2)表達(dá)的改變。利用GelImage Analysis V2.02軟件分析各條帶的灰度值,BDNF,TrkB和CRMP-2蛋白的相對(duì)量分別以BDNF,TrkB和CRMP-2條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示。
結(jié)果:1.BDNF: P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PD組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
12、;Y組與P組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);F組及D組與C組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.TrkB:P組、PD組及D組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PD組及D組與P組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Y組與P組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);F組與C組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.CRMP-2:P組及PD組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
13、(P<0.05);與P組比較,PD組、Y組數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);F組及D組與C組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:1.丙泊酚減少體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元BDNF,TrkB和CRMP-2的表達(dá)可能是丙泊酚影響海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育的分子機(jī)制之一;2.右美托咪定使丙泊酚孵育的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中BDNF,TrkB和CRMP-2的表達(dá)增加,可能是右美托咪定能減少丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起及突觸發(fā)育影響的可能分
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