胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型的建立及相關(guān)神經(jīng)毒性研究.pdf

1、研究背景:
　　近10年來(lái)，臨床回顧性分析研究已經(jīng)證實(shí)，新生兒及嬰幼兒早期接受全身麻醉和鎮(zhèn)靜，可引起隨后的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，包括學(xué)習(xí)能力下降、認(rèn)知功能減弱等。這一結(jié)果，不僅引起醫(yī)療專家的關(guān)注，也引起了管理者和患兒家長(zhǎng)的廣泛重視。尤其，隨著孕期婦女非產(chǎn)科手術(shù)比例的增加(0.15％-2％)，全身麻醉是否會(huì)影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，導(dǎo)致出生后的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，成為臨床麻醉關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　靜脈麻醉藥物丙泊酚（又名異丙酚，英文名

2、稱Propofol，化學(xué)名2，6-二異丙基苯酚）因起效迅速、代謝快而完全、蘇醒快而平穩(wěn)、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各類手術(shù)的全麻誘導(dǎo)和維持中，尤其適用于嬰幼兒手術(shù)麻醉、氣管插管、內(nèi)鏡檢查等操作和ICU的鎮(zhèn)靜。然而，與其他麻醉藥物的神經(jīng)毒性作用相似，研究發(fā)現(xiàn)，早期接觸丙泊酚也可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致長(zhǎng)期的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如學(xué)習(xí)、認(rèn)知能力下降。進(jìn)一步研究還證實(shí)，丙泊酚可影響突觸的形成過(guò)程，通過(guò)影響樹(shù)突棘的形態(tài)和濃度，突

3、觸結(jié)構(gòu)的數(shù)量來(lái)改變神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形，出現(xiàn)行為的異常。目前關(guān)于丙泊酚對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)影響的研究較少，尤其是胚胎期丙泊酚暴露，是否會(huì)通過(guò)影響mbp、syn2a基因和蛋白的表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙？為解決這一疑問(wèn)，需要更多的研究探討丙泊酚暴露對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　由于哺乳動(dòng)物胚胎宮內(nèi)發(fā)育的特點(diǎn)，目前較少有丙泊酚對(duì)活體胚胎期生物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響的文獻(xiàn)報(bào)道，

4、因此，需要建立新的動(dòng)物模型，探討胚胎期丙泊酚暴露的神經(jīng)毒性作用。憑借斑馬魚(yú)模式動(dòng)物的諸多優(yōu)勢(shì)，本研究通過(guò)建立胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型，探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的神經(jīng)毒性作用，包括對(duì)胚胎發(fā)育生存率、孵化率和畸形率的影響;對(duì)胚胎細(xì)胞凋亡的影響及對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的影響。研究成果，不僅能為基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)，更重要的是可為臨床應(yīng)用提供重要參考，為如何安全有效的開(kāi)展孕婦及新生兒、嬰幼兒麻醉工作，提供科學(xué)依據(jù)。

5、
　　研究目的:
　　1.建立胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型;
　　2.探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中生存率、孵化率和畸形率的影響及對(duì)7dpf幼魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)的影響;
　　3.探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)的分子制;
　　4.探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的響。
　　研究?jī)?nèi)容與方法:
　　1.建立胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型
　

6、　目前，尚無(wú)采用斑馬魚(yú)研究丙泊酚神經(jīng)毒性作用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本研究的第一部分內(nèi)容是建立斑馬魚(yú)胚胎丙泊酚暴露模型。以受精后的斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間和不同濃度丙泊酚暴露下，胚胎發(fā)育孵化率、畸形率和生存率的變化來(lái)確定合理的暴露濃度和時(shí)間。具體內(nèi)容如下:
　　1)為確定斑馬魚(yú)胚胎丙泊酚暴露濃度和暴露時(shí)間，將受精后6-48小時(shí)(6-48hpf，hours post-fertilization)的胚胎浸泡于含不同濃

7、度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、9μg/ml）和含相同劑量DMSO（丙泊酚溶劑，0.013％）及空白對(duì)照幼魚(yú)孵化水中。24hpf時(shí)將各組受試液均更新一半（含丙泊酚和DMSO溶液），48hpf全部更換為孵化水。
　　2)為檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露的一般毒性作用，分別在24、48、72、96和120hpf時(shí)，記錄各實(shí)驗(yàn)組胚胎生存率、孵化率、畸形率以及畸形特征。
　　3)為檢測(cè)胚胎期丙泊

8、酚暴露對(duì)腦部發(fā)育的影響，取暴露后7dpf(days post-fertilization)幼魚(yú)，通過(guò)HE染色檢測(cè)其腦部細(xì)胞數(shù)量和腦室腔的變化。
　　4)為檢測(cè)丙泊酚的麻醉效果，取健康6dpf幼魚(yú)分別浸泡于含不同濃度丙泊酚（1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml）、含相同劑量DMSO(0.013％)及空白對(duì)照養(yǎng)魚(yú)水中，浸泡30min后全部更換為新鮮養(yǎng)魚(yú)水，觀察24h。通過(guò)記錄各組幼魚(yú)麻醉起效時(shí)間、復(fù)蘇時(shí)間及死亡率來(lái)評(píng)價(jià)丙泊酚的麻醉

9、效應(yīng)。
　　2.檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露的神經(jīng)毒性作用
　　哺乳類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)，出生后早期丙泊酚暴露可以引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型建立成功后，第二部分研究?jī)?nèi)容就是檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。同時(shí)，進(jìn)一步探討了胚胎期丙泊酚暴露對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的影響。具體內(nèi)容如下:
　　1)為檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露的促細(xì)胞凋亡作用，取暴露后36hpf胚胎

10、，通過(guò)整體吖啶橙染色，比較各組胚胎整體凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化。
　　2)為檢測(cè)丙泊酚促細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制，取暴露后36hpf胚胎，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表達(dá)的變化。
　　3)為檢測(cè)丙泊酚對(duì)孵化后幼魚(yú)的神經(jīng)毒性作用，取經(jīng)暴露后3dpf幼魚(yú)，通過(guò)整體吖啶橙染色，比較各組幼魚(yú)腦部凋亡細(xì)胞的變化。
　　4)為檢測(cè)丙泊酚對(duì)孵化后幼魚(yú)的神經(jīng)毒性

11、作用，取經(jīng)暴露后3dpf幼魚(yú)，通過(guò) qRT-PCR、整體原位雜交技術(shù)和western blots法，分析mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.1 2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚神經(jīng)毒性作用的最佳濃度。
　　2.1 2、3μg/ml丙泊酚具有麻醉效果。
　　3.丙泊酚可影響7dpf幼魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)
　　比較經(jīng)胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露，發(fā)育至7dpf魚(yú)的腦部組織結(jié)

12、構(gòu)可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，丙泊酚處理組幼魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)腔隙增大，細(xì)胞數(shù)量減少。提示，胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)腦部發(fā)育具有毒性作用。
　　4.丙泊酚可誘導(dǎo)36hpf胚胎細(xì)胞凋亡增加，上調(diào)caspase-3、-8和-9 mRNA表達(dá)
　　研究已經(jīng)證實(shí)，丙泊酚可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，那么對(duì)于斑馬魚(yú)是否具有相同的作用呢？本研究顯示:在對(duì)照組中，36hpf胚胎整體未見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞信號(hào);在1、2、3μg/ml丙泊酚組，在胚胎頭

13、部、尾部均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，數(shù)量明顯增多。
　　Caspase家族參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序的重要機(jī)制之一，其中caspase-3、caspase-8和caspase-9在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丙泊酚暴露組胚胎體內(nèi)caspase-3、-8、-9 mRNA表達(dá)均顯著增高(P＜0.05)。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，caspase-8和caspase-9在三個(gè)劑量丙泊酚暴露組的表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)(P＜0.05)

14、。以上結(jié)果提示，胚胎期丙泊酚暴露引起的促細(xì)胞凋亡作用可能與caspase信號(hào)通路的激活有關(guān)，且丙泊酚的神經(jīng)毒性作用隨著藥物濃度的增高而增強(qiáng)。
　　5.丙泊酚可誘導(dǎo)3dpf幼魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡增多
　　3dpf是斑馬魚(yú)胚胎孵化為幼魚(yú)的關(guān)鍵時(shí)期，為檢測(cè)丙泊酚促細(xì)胞凋亡作用的持續(xù)性，本研究分析了3dpf幼魚(yú)腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，丙泊酚暴露組腦部凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增多(P＜0.05)。并且，3μg/ml丙泊酚

15、暴露組腦部凋亡細(xì)胞數(shù)量高于1μg/ml丙泊酚暴露組(P＜0.05)。提示丙泊酚的促細(xì)胞凋亡作用具有持續(xù)性，且隨著藥物濃度的增高而增強(qiáng)。
　　6.丙泊酚可下調(diào)mbp mRNA及蛋白的表達(dá)
　　Mbp和syn2a基因是突觸形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用的兩種基因。然而，目前很少有研究探討丙泊酚對(duì)此兩種基因表達(dá)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露后，各組3dpf幼魚(yú)mbp mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。通過(guò)整

16、體原位雜交法發(fā)現(xiàn)，mbp mRNA下調(diào)程度可分為三個(gè)級(jí)別:無(wú)變化、輕度下降和嚴(yán)重下降。整體原位雜交結(jié)果還顯示，mbp mRNA表達(dá)的下降主要表現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，外周神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)無(wú)顯著差異。Mbp蛋白檢測(cè)也顯示一致結(jié)果，與對(duì)照組相比，丙泊酚暴露組幼魚(yú)Mbp蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性下降(P＜0.05)。然而，分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丙泊酚暴露組幼魚(yú)syn2a基因mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.

17、將6-48hpf斑馬魚(yú)胚胎通過(guò)浸泡方式暴露于含1、2、3μg/ml丙泊酚幼魚(yú)孵化水中，是研究胚胎期丙泊酚暴露神經(jīng)毒性作用的最佳動(dòng)物模型;
　　2.胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育具有毒性作用，表現(xiàn)為:延遲胚胎孵化的時(shí)間，引起胚胎發(fā)育的畸形及影響腦組織結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育;
　　3.胚胎期丙泊酚暴露可引起胚胎整體細(xì)胞凋亡增多，且細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能與caspase-3、-8、-9參與的信號(hào)通路的激活有關(guān)。
　　4.胚胎期丙泊酚暴