異丙酚對原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷的影響研究.pdf

1、建立新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法,并利用Annexin V-PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)過程中細(xì)胞早期凋亡和死亡情況.取新生Wister大鼠,無菌條件下斷頭、取腦、解剖顯微鏡下分離出海馬組織,采用胰蛋白酶消化和機(jī)械分離相結(jié)合方法分離神經(jīng)細(xì)胞.接種在事先包被0.01%多聚左旋賴氨酸的35mm無菌培養(yǎng)皿,置于37℃ 10%CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng).24h后更換為培養(yǎng)液.3~5d天后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖,48h后更換為新鮮培養(yǎng)

2、液.取培養(yǎng)6~8d細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)染色.分別收獲第0、1、3、5、8、11及18d細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-PI染色,利用流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元早期凋亡和死亡.相差顯微鏡下可見神經(jīng)細(xì)胞,特征明顯并形成典型的神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò).NSE在神經(jīng)細(xì)胞胞漿呈陽性著色.新分離細(xì)胞存活率為83.72%,早期凋亡率15.22%;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,細(xì)胞存活率隨時(shí)間降低,而死亡率與早期凋亡率增高.在每一檢測點(diǎn)早期凋亡檢出率所占絕對