9-順式維甲酸的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究采用人胃低分化黏液腺癌細(xì)胞(MGC80-3)為靶細(xì)胞，觀察9-順式維甲酸(9-cisRA)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞周期影響和凋亡誘導(dǎo)作用，以及9-cisRA對(duì)RXRα核受體表達(dá)及細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4表達(dá)的影響，探討9-cisRA抑制腫瘤的作用機(jī)制。 方法：1MTT比色法檢測(cè)9-cisRA的抗癌活性。 2倒置光顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；Hoechst33

2、342/PI雙熒光染色，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)凝集及區(qū)分壞死細(xì)胞。 3流式細(xì)胞術(shù)分析9-cisRA對(duì)細(xì)胞周期的影響和誘導(dǎo)凋亡率的變化。 4瓊脂糖凝膠電泳分析凋亡細(xì)胞DNA片段。 5RT-PCR法檢測(cè)9-cisRA對(duì)RXRα、CyclinD1、CDK4mRNA水平表達(dá)的影響。 結(jié)果：1生長(zhǎng)抑制作用：9-cisRA可抑制MGC80-3細(xì)胞生長(zhǎng)，10μmol/L濃度作用96h最大抑制率達(dá)64.72％，半

3、數(shù)抑制濃度為8.07μmol/L，并且9-cisRA的生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間-劑量依賴性。 2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。MGC80-3為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，9-cisRA作用后，細(xì)胞由多角形變成圓形，細(xì)胞折光性降低，胞漿內(nèi)顆粒增多。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，部分細(xì)胞脫壁呈半懸浮狀態(tài)，隨后細(xì)胞皺縮，裂解似爆炸開(kāi)的“菜花狀”；熒光顯微鏡下可見(jiàn)，9-cisRA組細(xì)胞染色質(zhì)濃縮呈亮珠狀并形成凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；電鏡下

4、可見(jiàn)凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞器變性，染色質(zhì)邊集，沿核膜內(nèi)緣呈團(tuán)塊狀分布。 39-cisRA對(duì)細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞儀分析顯示，10μmol/L的9-cisRA處理MGC80-3細(xì)胞，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，S期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯減低，細(xì)胞阻滯于G1期，尤以96h最為明顯，G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高，由對(duì)照組的(61.5±2.2)％增加到(74.3±4.7)％，同時(shí)處于S期的細(xì)胞數(shù)減少，由對(duì)照組的(26.3±1.3)％減少到(17.2

5、±1.4)％，此時(shí)凋亡細(xì)胞明顯增多，說(shuō)明9-cisRA可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和DNA的合成。 4凋亡率：9-cisRA誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，藥物作用后72h開(kāi)始出現(xiàn)典型亞二倍體凋亡峰，于96h最明顯，此時(shí)細(xì)胞凋亡率達(dá)68.5％。 5瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果：10μmol/L的9-cisRA處理MGC80-3細(xì)胞72、96、120h，從中提取的DNA電泳，72h開(kāi)始出現(xiàn)明顯的梯狀帶，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，梯狀帶條帶

6、增多，條帶亮度也增加。 69-cisRA對(duì)RXRα、CyclinD1、CDK4mRNA表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較，96h實(shí)驗(yàn)組RXRα受體表達(dá)增加，CyclinD1、CDK4表達(dá)均出現(xiàn)下降，說(shuō)明9-cisRA的作用機(jī)制與RXRα表達(dá)增加和CyclinD1、CDK4表達(dá)下降有關(guān)。 結(jié)論：19-cisRA可明顯抑制MGC80-3細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴性。 29-cisRA可誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡，9