9-甲氧基喜樹(shù)堿(MCPT)抗腫瘤作用及其機(jī)制研究.pdf

1、喜樹(shù)堿(Camptothecin,CPT)由于高效、廣譜的抗腫瘤活性而位居癌癥治療前列,但明顯的毒副作用限制了它在臨床上的使用,因而開(kāi)發(fā)抗腫瘤活性強(qiáng)、毒副作用小的衍生物成為了國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。9-甲氧基喜樹(shù)堿(9-Methoxycamptothecin,MCPT),一種喜樹(shù)堿衍生物,體內(nèi)外試驗(yàn)均證實(shí)有明顯的抗多種腫瘤活性,但對(duì)其有關(guān)細(xì)胞和分子方面的機(jī)制研究極少。本課題首先體外評(píng)價(jià)了9-甲氧基喜樹(shù)堿的抗腫瘤細(xì)胞活性,并從9-甲氧基喜樹(shù)堿誘導(dǎo)

2、腫瘤細(xì)胞凋亡、影響DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性及其與DNA分子相互作用等三個(gè)方面進(jìn)行了作用機(jī)制的研究。
　　1.評(píng)價(jià)9-甲氧基喜樹(shù)堿體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明,9-甲氧基喜樹(shù)堿抑制7種腫瘤細(xì)胞系,呈劑量依賴性。其中,人卵巢癌細(xì)胞A2780和人宮頸癌細(xì)胞Hela對(duì)9-甲氧基喜樹(shù)堿最為敏感,其IC50值分別為79±21nM和151±61nM,明顯低于陽(yáng)性對(duì)照藥物10-羥基喜樹(shù)堿(Hydroxycamptothecin,HCPT)。選取這兩種細(xì)胞

3、系開(kāi)展后續(xù)作用機(jī)制研究。
　　2.研究了9-甲氧基喜樹(shù)堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制。結(jié)果表明:(1)9-甲氧基喜樹(shù)堿處理A2780和Hela細(xì)胞后,熒光顯微鏡下觀察到誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)到明顯的早期和晚期凋亡細(xì)胞。9-甲氧基喜樹(shù)堿誘導(dǎo)A2780細(xì)胞的早期凋亡和總凋亡率增加具有時(shí)間-劑量依賴性;(2)9-甲氧基喜樹(shù)堿處理A2780和Hela細(xì)胞24h后即表現(xiàn)出強(qiáng)的G2/M期阻滯。1×IC50濃度的9-甲氧基喜樹(shù)堿處理A278

4、0細(xì)胞24h后對(duì)G2/M期阻滯最明顯,達(dá)到81.93％;(3)9-甲氧基喜樹(shù)堿能使A2780和Hela細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧(ROS)明顯增多。A2780細(xì)胞中ROS產(chǎn)生量最高達(dá)到對(duì)照組的5.22倍,Hela細(xì)胞中最高為2.65倍;(4)9-甲氧基喜樹(shù)堿能不同程度激活caspase-3,-8和-9。在A2780細(xì)胞中對(duì)caspase-9酶激活程度最強(qiáng),是對(duì)照組細(xì)胞的15倍。Hela細(xì)胞中caspase-3的酶活性被顯著提高,約為對(duì)照組細(xì)胞的8

5、倍;(5)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到9-甲氧基喜樹(shù)堿調(diào)節(jié)了17個(gè)內(nèi)、外源性細(xì)胞凋亡通路及細(xì)胞周期相關(guān)基因。其中對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控基因p21,p27和cyclinE上調(diào)較顯著;且明顯上調(diào)參與外源性細(xì)胞凋亡通路的TNFα、Fas和FasL;同時(shí)還調(diào)節(jié)了主要參與內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路的bcl-2家族有關(guān)基因表達(dá)水平;(6)Westernblot檢測(cè)到TNFα,Fas,P53和P27的蛋白表達(dá)水平上調(diào),與其基因水平調(diào)節(jié)一致。綜上所述,9-甲氧基喜樹(shù)堿可通過(guò)調(diào)

6、節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,并增加ROS的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)bcl-2家族相關(guān)基因激活caspase-9,從而啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路;同時(shí)激活了caspase-8啟動(dòng)以TNFα和Fas/FasL為主的外源性細(xì)胞凋亡通路。以上兩條通路共同激活caspase-3,最終導(dǎo)致A2780和Hela細(xì)胞凋亡。
　　3.研究了9-甲氧基喜樹(shù)堿對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ活性的影響。結(jié)果顯示,100μM的9-甲氧基喜樹(shù)堿表現(xiàn)出對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

7、明顯的抑制作用,與陽(yáng)性對(duì)照藥物喜樹(shù)堿一樣,可使超螺旋DNA產(chǎn)生明顯的缺刻型DNA條帶。不同濃度的9-甲氧基喜樹(shù)堿均未表現(xiàn)出對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的抑制作用(與陽(yáng)性對(duì)照藥物依托泊苷相比)。值得注意的是,100μM的9-甲氧基喜樹(shù)堿能單獨(dú)作用于超螺旋DNA并產(chǎn)生明顯的缺刻型DNA產(chǎn)物,表明9-甲氧基喜樹(shù)堿在沒(méi)有拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ存在的情況下也能作用于DNA。提示,9-甲氧基喜樹(shù)堿的這種直接結(jié)合DNA的能力很有可能是其抗腫瘤活性強(qiáng)的一種重要機(jī)制。
　

8、　4.采用光譜法研究了9-甲氧基喜樹(shù)堿與DNA分子相互作用。結(jié)果表明,(1)紫外-可見(jiàn)吸收光譜顯示,隨著不斷滴加CT-DNA,9-甲氧基喜樹(shù)堿最大吸收峰出現(xiàn)了增色效應(yīng),譜帶未發(fā)生偏移,表明其與DNA的作用屬于外部鍵合模式(溝槽作用和/或靜電作用)。9-甲氧基喜樹(shù)堿處理CT-DNA前后體系的解鏈溫度(meltingtemperature,Tm)值升高不明顯,也支持外部鍵合模式;(2)熒光光譜顯示,隨著CT-DNA濃度不斷增加,9-甲氧基喜

9、樹(shù)堿熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng),沒(méi)有發(fā)生明顯光譜偏移現(xiàn)象,支持外部鍵合模式;(3)9-甲氧基喜樹(shù)堿與CT-DNA相互作用的圓二色譜顯示,9-甲氧基喜樹(shù)堿加入后,體系的正峰有小的提升,而其負(fù)峰有較明顯的回落并伴有輕微的吸收峰紅移現(xiàn)象。由于負(fù)峰變化程度大于正峰,表明兩者結(jié)合以溝槽模式為主。綜上可知,9-甲氧基喜樹(shù)堿與CT-DNA的結(jié)合方式以溝槽模式為主。
　　綜合以上研究結(jié)果表明,9-甲氧基喜樹(shù)堿具有明顯的抗多種腫瘤細(xì)胞活性,其作用機(jī)制主要是通