蝙蝠葛活性成分抗腫瘤作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究蝙蝠葛活性成分體外對(duì)人白血病K562細(xì)胞株的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，并探討其作用機(jī)制，以及蝙蝠葛活性成分體內(nèi)對(duì)S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用，為新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法：應(yīng)用MTT法檢測(cè)蝙蝠葛活性成分對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞株的抑制增殖作用的影響及細(xì)胞毒活性；通過倒置顯微鏡、HE染色及透射電鏡對(duì)K562細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)K562細(xì)胞的周期分布相和細(xì)胞凋亡率；通過免疫細(xì)胞化學(xué)S-P法

2、測(cè)定凋亡關(guān)鍵效應(yīng)酶Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表達(dá)情況，深入探討蝙蝠葛活性成分對(duì)人白血病K562細(xì)胞株誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制；采用寇氏（Korbor）法計(jì)算小鼠急性經(jīng)口LD50及其95％可信限；用蝙蝠葛活性成分灌胃觀察其對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用；采用血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，觀察含藥血清體外對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株抗增殖作用；采用生命延長(zhǎng)率實(shí)驗(yàn)方法，用蝙蝠葛活性成分灌胃觀察其對(duì)S180肉瘤小鼠的生命延長(zhǎng)作用。

3、r>　　結(jié)果：
　?。?）MTT比色法結(jié)果表明，蝙蝠葛活性成分對(duì)人白血病K562細(xì)胞株的增殖抑制作用呈劑量依賴性；
　?。?）倒置顯微鏡觀察：蝙蝠葛活性成分20μg/ml作用后早期細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化：細(xì)胞膜鼓泡、凋亡小體形成等；作用晚期細(xì)胞發(fā)生膜破裂壞死；
　?。?）HE染色：蝙蝠葛活性成分20μg/ml作用細(xì)胞后出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)變化凋亡小體形成、細(xì)胞核濃縮呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色等，核染色質(zhì)濃縮、呈碎塊狀；

4、　　（4）透射電鏡觀察結(jié)果：蝙蝠葛活性成分20μg/ml作用細(xì)胞后出現(xiàn)核染色質(zhì)致密濃縮或斷裂，形成大小不等的凋亡小體；
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：蝙蝠葛活性成分可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，加藥組出現(xiàn)亞二倍體峰，并且 GO/G1期細(xì)胞比例顯著增加，而S期和 G2/M期細(xì)胞比例則明顯下降,將細(xì)胞阻滯在 GO/G1期；
　?。?）免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明：蝙蝠葛活性成分作用后加藥組Caspase—9、Caspase-8和Ca

5、spase-3表達(dá)增加，與對(duì)照組相比較均有顯著差異；
　?。?）急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蝙蝠葛活性成分的小鼠急性經(jīng)口LD50及其95%可信限為52.72g/kg和38.12—63.87 g/kg；
　?。?）蝙蝠葛活性成分小、中、大劑量組對(duì)小鼠移植性肉瘤S180實(shí)體瘤的抑瘤率分別為17.19%、33.43%、42.29%，有顯著的抑制作用；
　　（9）血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，終濃度分別為10%、20%、25%的滅活的含藥（蝙蝠葛

6、活性成分）大白鼠血清對(duì) A549細(xì)胞株的增殖抑制率分別為29.03%、30.55%、41.67%，對(duì)照組相比P＜0.05；
　?。?0）生命延長(zhǎng)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果小劑量及中劑量組延長(zhǎng)率為41.66%與33.33%，與對(duì)照組相比P＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1、蝙蝠葛活性成分對(duì)人白血病K562細(xì)胞株具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。
　　2﹑蝙蝠葛活性成分對(duì)K562細(xì)胞抑制增殖作用在20μg/ml作用24h之前主要以誘導(dǎo)凋亡為

7、主。
　　3、蝙蝠葛活性成分誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制可能與細(xì)胞周期發(fā)生 G0/G1期阻滯有關(guān)；并且通過上調(diào)Caspase-9、spase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)，經(jīng)由細(xì)胞凋亡的死亡受體通路和線粒體通路完成凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行。
　　4、蝙蝠葛活性成分對(duì)S180荷瘤小鼠具有延長(zhǎng)生命的作用，同時(shí)對(duì)小鼠移植性S180肉瘤具有抑制作用。
　　5、蝙蝠葛活性成分含藥血清在體外對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株增殖有抑制作用。
　　6、急性