土槿乙酸抗腫瘤作用機制的研究.pdf

1、土槿乙酸是從松科植物金錢松根皮中分離的新型二萜酸化合物，具有抗真菌、抗生育、抗血管生成和抗腫瘤等作用。近年來研究證實土槿乙酸對肝癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抗腫瘤活性，且多與p53蛋白表達相關，但確切的作用機制目前仍未清楚。
　　 本文擬以表達野生型p53和突變型p53的腫瘤細胞為研究對象，探討土槿乙酸的抗腫瘤作用機制。因消化道腫瘤（胃癌，肝癌和結腸癌）屬于易發(fā)生p53突變的惡性腫瘤，而黑色素瘤常常表達野

2、生型p53，很少發(fā)生p53的突變，故選擇這兩類具有代表性和普遍性的人腫瘤細胞系作為研究的對象。首先檢測了土槿乙酸對不同人腫瘤細胞系的抑瘤作用，然后選擇敏感性高且具有代表性的人胃癌MGC803（突變型p53）、AGS（野生型p53）和黑色素瘤SK-28（野生型p53）細胞株作為研究對象，系統(tǒng)研究了土槿乙酸抗腫瘤作用的機制，為土槿乙酸可能成為新型抗腫瘤藥物提供實驗數據和理論依據。
　　 第一部分土槿乙酸對不同人腫瘤細胞系的抑瘤作用<

3、br>　　 目的：檢測土槿乙酸對不同人腫瘤細胞系的抑瘤作用，篩選出對土槿乙酸敏感且具有代表性的細胞系，作為土槿乙酸抗腫瘤作用機制研究的細胞模型。
　　 方法：采用四唑氮藍還原法（MTT）檢測土槿乙酸對人胃癌MGC803、AGS、肝癌SMMC7721、結腸癌LOVO、人黑色素瘤A375、SK-28和624mel細胞增殖的抑制作用。運用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術檢測PPARγ在人胃癌MGC803、肝癌SMMC7721

4、、結腸癌LOVO細胞中的mRNA表達。
　　 結果：
　　 1.土槿乙酸對人胃癌MGC803、AGS、肝癌SMMC7721細胞抑制作用顯著，且呈時間和劑量依賴性，IC50值分別為AGS（0.89μmol/L）　　 2.土槿乙酸對人黑色素瘤A375，SK-28和624mel細胞抑制作用顯著，且呈時間和劑量

5、依賴性，IC50值分別為SK～28（1.12μmol/L）　　 3.PPARγ在人消化道腫瘤細胞株MGC803、SMMC7721、LOVO中均有表達，這對土槿乙酸發(fā)揮抗腫瘤作用可能是必要的。
　　 小結：土槿乙酸對表達野生型和突變型p53的腫瘤細胞均具有明顯的生長抑制作用，提示土槿乙酸具有較強的抗腫瘤作用，有望成為一種新的腫瘤治療藥物。
　

6、　 第二部分土槿乙酸對p53野生型和突變型人胃癌細胞凋亡的影響及其可能機制的對比研究
　　 目的：對比研究土槿乙酸對人胃癌MGC803和AGS細胞凋亡的影響及其可能機制。
　　 方法：應用Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析檢測細胞凋亡的改變；應用流式細胞術分析細胞周期的變化；應用蛋白檢測和RT-PCR技術檢測參與細胞凋亡和細胞周期運行的相關基因的蛋白和mRNA表達。
　　 結果：

7、r>　　 1.Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析證實，土槿乙酸明顯誘導人胃癌AGS、MGC803細胞凋亡產生；
　　 2.流式細胞術分析顯示，土槿乙酸誘導人胃癌AGS、MGC803細胞G2期阻遏；
　　 3.10μmol/L土槿乙酸作用AGS細胞12h后可見p53表達增加，在36h達到峰值，24h后可見p21WAF1/CIP1表達明顯增加；作用MGC803細胞12h后明顯上調PPAR7mRN

8、A表達，24h后可見p21WAF1/CIP1表達明顯增加；
　　 4.土槿乙酸作用于AGS、MGC803細胞后，增加了Fas/APO-1蛋白表達和促凋亡蛋白BaxmRNA表達，降低了抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表達，提高了caspase-3活性。
　　 小結：
　　 1.土槿乙酸能明顯誘導人胃癌細胞凋亡和細胞周期阻滯；
　　 2.土槿乙酸通過Bcl-2介導的線粒體途徑和Fas/APO-1介導的死亡受體途

9、徑誘導胃癌細胞凋亡；
　　 3.p53野生型的胃癌細胞，其凋亡途徑的激活可能與p53表達有關；p53突變型的胃癌細胞，其凋亡途徑的激活可能與PPAR7表達有關。
　　 第三部分土槿乙酸對p53野生型人黑色素瘤細胞抗增殖作用機理的研究
　　 目的：研究土槿乙酸抗人黑色素瘤細胞增殖的機制。
　　 方法：采用Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析技術檢測細胞凋亡的改變；應用流式細胞術分析

10、細胞周期的變化；運用Westernblot和RT-PCR技術檢測參與細胞凋亡和細胞周期運行的相關基因的蛋白和mRNA的表達。
　　 結果：
　　 1.Hoechst33342/PI核熒光雙染色法、DNA片段化分析證實土槿乙酸能明顯誘導人黑色素瘤SK-28細胞凋亡產生；
　　 2.流式細胞術分析顯示土槿乙酸誘導人黑色素瘤SK-28細胞G2/M期阻遏：（1）土槿乙酸作用SK-28細胞4h，增加了Cdc2的磷酸化水平，

11、24 h下調了其蛋白水平表達。（2）土槿乙酸降低了Cdc25C磷酸酶蛋白表達，提高了Weel激酶蛋白表達。（3）土槿乙酸能明顯誘導p53下游靶基因p21WAF1/CIP1蛋白表達，降低Cdc2的活性。（4）土槿乙酸增加了ATM激酶活性，提高了細胞周期檢測點激酶Chk2和p53蛋白表達及p53磷酸化水平，這些作用可被ATM激酶抑制劑咖啡因阻斷；
　　 3.土槿乙酸作用于SK-28細胞后，增加了Fas/APO-1蛋白表達和促凋亡蛋白

12、Bax mRNA表達，降低了抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表達；提高了caspase-3活性。
　　 小結：
　　 1.土槿乙酸可通過依賴ATM-p53-p21WAF1/CIP1信號途徑和ATM-Chk2-Cdc25C信號途徑誘導人黑色素瘤SK-28細胞周期G2/M期阻滯。
　　 2.土槿乙酸可通過Bcl-2介導的線粒體途徑和Fas/APO-1介導的死亡受體途徑誘導人黑色素瘤SK-28細胞凋亡。
　　 3

13、.凋亡途徑的激活可能與p53表達有關。
　　 結論：
　　 1.土槿乙酸具有較強的抗腫瘤作用，有望成為一種新的抗腫瘤藥物；
　　 2.土槿乙酸可通過Bcl-2介導的線粒體途徑和Fas/APO-1介導的死亡受體途徑誘導人胃癌和黑色素瘤細胞凋亡，提示誘導細胞凋亡可能是土槿乙酸抗癌作用的機制之一；
　　 3.土槿乙酸可通過依賴ATM-p53-p21WAF1/CIP1信號途徑和ATM-Chk2-Cdc25C信號途