Telekin抗腫瘤多藥耐藥作用及機(jī)制研究.pdf

1、全球癌癥發(fā)病率居高不下，癌癥作為一種惡性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康。作為如今腫瘤的主要治療方法之一的化療法，其治療效果受到腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥作用的限制。因此，開發(fā)抗癌活性高，并且能夠抗癌細(xì)胞多藥耐藥的抗腫瘤藥物成為了抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。本課題針對(duì)Telekin的抗腫瘤多藥耐藥作用及其機(jī)制展開相關(guān)研究工作，所用到的研究對(duì)象-化合物Telekin是從天然植物金挖耳中提取的一種桉烷內(nèi)酯類化合物，在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腫瘤活性?；谇?/p>

2、期Telekin抗腫瘤機(jī)制的研究結(jié)果，本論文發(fā)現(xiàn)其對(duì)多藥耐藥的癌細(xì)胞也有抑制作用并進(jìn)一步展開機(jī)制探討工作。
　　我們選取了三組耐藥及其親本細(xì)胞株K562、K562/A02，KB、KB/VCR,MCF-7、MCF-7/ADR進(jìn)行藥物敏感性篩選。MTT結(jié)果顯示，Telekin對(duì)于多藥耐藥細(xì)胞具有直接的較強(qiáng)毒性，與傳統(tǒng)化療藥物長(zhǎng)春新堿，阿霉素等相比具有不受耐藥泵影響的優(yōu)勢(shì)，且對(duì)K562/A02及K562細(xì)胞的藥物敏感性高于其他兩對(duì)組織來(lái)

3、源的細(xì)胞株，對(duì)K562/A02及K562的細(xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)出時(shí)間及濃度的依賴性。采用Annexin V/PI雙染法以及DAPI染色對(duì)經(jīng)Telekin處理48h后的K562/A02及K562細(xì)胞進(jìn)行調(diào)亡檢測(cè)。結(jié)果顯示，Telekin對(duì)K562/A02及K562具有都誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的作用，Western Blot對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族以及Caspase家族蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)后，我們發(fā)現(xiàn)在Telekin的作用下，K562/A02細(xì)胞

4、中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低，凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)量升高;未活化的Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達(dá)量降低，同時(shí)其活化形式的CleavedCaspase-9和Cleaved Caspase-3的表達(dá)量明顯增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴性。以上結(jié)果表明，Telekin可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族及Caspase家族蛋白表達(dá)，誘導(dǎo) K562/A02細(xì)胞凋亡。
　　在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們主要對(duì)Telekin抗多藥耐藥的作用機(jī)制進(jìn)

5、行相關(guān)研究。由于P-gp泵對(duì)藥物的外排被認(rèn)為是引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用的主要因素之一。我們首先采用Rh123及阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的累積實(shí)驗(yàn)對(duì)Telekin處理的K562/A02細(xì)胞中的P-gp進(jìn)行探究。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)非毒性劑量Telekin處理的K562/A02細(xì)胞內(nèi)的Rh123及阿霉素積累量無(wú)明顯增加，Telekin(10μmol/L，20μmol/L)處理的K562/A02細(xì)胞內(nèi)Rh123及阿霉素累積量有明顯增加。由此，我們

6、推測(cè)，Telekin可能不是通過(guò)增加化療藥物的細(xì)胞內(nèi)含量，而是直接誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡，由于在毒性劑量下Telekin抑制耐藥細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)，從而引起P-gp泵功能的下調(diào)。進(jìn)而，我們對(duì)Telekin抑制P-gp轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)做進(jìn)一步的探討。我們用流式細(xì)胞儀，Western Blot及實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)P-gp蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)不同濃度Telekin處理的K562/A02細(xì)胞中P-gp的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，且

7、呈現(xiàn)出濃度依賴性。
　　我們也針對(duì)Telekin對(duì)另外兩種與多藥耐藥相關(guān)的蛋白MRP-1以及ABCG2的影響進(jìn)行了探究。由于ABCG2在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)，故我們選用人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/A及其親本細(xì)胞株MCF-7，針對(duì)Telekin對(duì)細(xì)胞中ABCG2的作用進(jìn)行研究。流式細(xì)胞儀和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，Telekin能夠抑制K562/A02細(xì)胞中MRP-1蛋白的表達(dá)量以及其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。米托蒽

8、醌累積實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)高濃度(20μmol/L)Telekin處理的MCF-7/A細(xì)胞內(nèi)米托蒽醌的累積量顯著增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴性。我們進(jìn)一步對(duì)ABCG2蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Western Blot以及RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度Telekin處理的MCF-7/A細(xì)胞中ABCG2的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)，Telekin也抑制耐藥細(xì)胞中MRP-1及ABCG2蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平的表

9、達(dá)。
　　由于P-gp的編碼基因MDR1啟動(dòng)子核心區(qū)域存在能夠與NF-κB相結(jié)合的特異性區(qū)域，ABCG2的啟動(dòng)子能夠與NF-κB的p50亞基結(jié)合。NF-κB通路的活化能夠上調(diào)P-gp及ABCG2蛋白的表達(dá)，最終引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用，故我們主要針對(duì)AKT/NF-κB信號(hào)通路對(duì)P-gp及ABCG2蛋白表達(dá)的調(diào)控進(jìn)行了進(jìn)一步探究。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，在Telekin處理的K562/A02及MCF-7/A細(xì)胞中pho

10、spho-AKT與NF-κ3表達(dá)量明顯降低，Ⅰ-κB的表達(dá)量升高。Telekin能夠通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/NF-κB信號(hào)通路，并且對(duì)其細(xì)胞中高表達(dá)的多藥耐藥作用相關(guān)蛋白P-gp、ABCG2的表達(dá)具有抑制作用。
　　綜上所述，Telekin能夠繞過(guò)多藥耐藥細(xì)胞中P-gp耐藥泵的作用，并下調(diào)多種多藥耐藥泵的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)直接誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞凋亡，是一個(gè)具有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤多藥耐藥的天然產(chǎn)物，我們的研究也為其今后的進(jìn)一步開發(fā)與臨床應(yīng)用提供了有