酶切富集AS-PCR法檢測(cè)bcr-abl融合基因T315I點(diǎn)突變及臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的克隆性骨髓增殖性腫瘤,90％以上患者可檢測(cè)到特征性的Ph染色體及其分子標(biāo)志bcr/abl融合基因,Ph染色體是由位于9q34的abl原癌基因斷裂并易位到22q11的斷裂點(diǎn)集簇區(qū) bcr融合形成[1]。隨著分子靶向治療藥物的廣泛使用,bcr/abl融合基因的突變是導(dǎo)致治療效果不佳的主要原因之一,且在疾病整個(gè)治療與預(yù)

2、后中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),T315I基因突變是目前治療CML耐藥最難以克服的基因突變[2],國(guó)外報(bào)道bcr/ablT315I突變?cè)贑ML患者中的發(fā)生率約占15%左右[3]。鑒于目前國(guó)內(nèi)關(guān)于bcr/ablT315I突變的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究擬通過(guò)建立一種可行的酶切富集等位基因特異性PCR(酶切富集AS-PCR)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)T315I基因突變,為CML的分子靶向治療及后續(xù)研究提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.設(shè)計(jì)包括

3、突變位點(diǎn)在內(nèi)的兩對(duì) PCR擴(kuò)增引物,以健康人外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA為模板,分別擴(kuò)增出野生型abl基因第6號(hào)外顯子片段和含有T315I突變的abl基因第6號(hào)外顯子片段,并將其分別克隆至pSG5M-flag載體質(zhì)粒中,構(gòu)建含abl基因野生型及T315I突變型重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,并將所獲重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。
　　2.酶切富集AS-PCR方法的建立。設(shè)計(jì)一對(duì)野生型和突變型abl基因序列的通用引物,分別以野生型和突變型重組質(zhì)粒作

4、為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增出目的片段,將擴(kuò)增出的片段進(jìn)行酶切。另設(shè)計(jì)一對(duì)僅針對(duì)T315I突變的特異性引物,以酶切產(chǎn)物為模板,進(jìn)行 AS-PCR檢測(cè),對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。分析該方法的靈敏度及特異性。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)體外定點(diǎn)突變PCR法成功構(gòu)建了野生型pSG5M-flag-abl(wild)和突變型pSG5M-flag-abl(T315I)的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,且經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定與預(yù)期結(jié)果一致。
　　2.成功運(yùn)用