應(yīng)用AdMax系統(tǒng)構(gòu)建人蛋白激酶Cβ-,2-重組腺病毒載體的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人蛋白激酶Cβ2基因開放讀碼框的克隆及序列分析 目的：克隆人蛋白激酶Cβ2基因(PRKCBl)的開放讀碼框(ORF)，為其進(jìn)一步的功能研究提供基礎(chǔ)。 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR法，從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株中擴(kuò)增出含PRKCBl基因ORF全長(zhǎng)的片段，所得片段經(jīng)加“A”處理并插入T載體。經(jīng)藍(lán)白篩選，用特異引物擴(kuò)增陽(yáng)性重組子，得到編碼人蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)基因的ORF，并與T載體相連，測(cè)序鑒定。 結(jié)果：通

2、過(guò)巢式RT-PCR及T/A克隆獲取了PRKCB1基因的ORF，測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道序列一致。 結(jié)論：成功克隆了PRKCB1基因的ORF，在技術(shù)路線上可以為某些難克隆的基因提供參考。 第二部分?jǐn)y帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因的人 PRKCB1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 目的：構(gòu)建攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因的人PRKCB1真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 方法：從已構(gòu)建且測(cè)序正確的pMD18-T-PRKCB1

3、質(zhì)粒中，擴(kuò)增出人PRKCB1并與帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pReceiver-M29酶切后連接、轉(zhuǎn)化，所獲重組體酶切鑒定及測(cè)序。按優(yōu)化的轉(zhuǎn)染參數(shù)，將pReceiver-M29-PRKCB1轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)，隨機(jī)視野下計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果：構(gòu)建的pReceiver-M29-PRKCB1質(zhì)粒測(cè)序與 GenBank公布的序列一致。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，熒光蛋白表達(dá)最佳，轉(zhuǎn)染率為18.62％。

4、 結(jié)論：成功構(gòu)建了pReceiver-M29-PRKCB1真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，為篩選穩(wěn)定表達(dá)人蛋白激酶Cβ2的內(nèi)皮細(xì)胞株，及其蛋白復(fù)合體分離提供分子工具。 第三部分應(yīng)用Cre/IoxP系統(tǒng)構(gòu)建人蛋白激酶Cβ2重組腺病毒載體及鑒定 目的：構(gòu)建人蛋白激酶 Cβ2重組腺病毒載體，為蛋白組學(xué)研究提供分子工具。 方法：從pMD18-T-PRKCB1質(zhì)粒中，擴(kuò)增出人PRKCB1。所得片

5、段定向克隆至穿梭質(zhì)粒pDC315上，然后與骨架質(zhì)粒pBHG10x△E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)同源重組構(gòu)建腺病毒Ad-PRKCB1，測(cè)定重組病毒的滴度，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR方法進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：酶切及PCR表明目的基因正確插入穿梭質(zhì)粒。同源重組后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，病毒包裝成功。擴(kuò)增純化后病毒滴度為7.9×10°IU/ml。RNA及蛋白質(zhì)水平鑒定顯示目的片段有效表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了含人蛋白