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文檔簡介
1、目的：（1）構(gòu)建人骨形態(tài)蛋白-2（Human bone morphogenetic protein-2，hBMP-2）基因的重組腺病毒載體并鑒定；
（2）檢測hBMP-2基因轉(zhuǎn)染對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymAlstem cells，BMSCs）的影響。
方法：（1）以人cDNA為模板PCR擴增hBMP-2基因，插入線性化的表達載體pAV-MCMV-EGFP-3FLAG
2、后，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子、陽性克隆測序無誤后，擴增、抽提，將帶有目的基因的腺病毒表達載體和攜帶有腺病毒大部分基因的輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞進行病毒包裝擴增，PCR檢測目的基因、Western Blot檢測目的蛋白及終點稀釋法檢測病毒滴度；
（2）分離純化SD大鼠BMSCs并體外擴增，通過腺病毒載體介導(dǎo)hBMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs，分別通過熒光顯微鏡觀察熒光表達情況、蛋白質(zhì)水平來測定轉(zhuǎn)
3、染后hBMP-2的表達、ALP定量測定鑒定成骨活性及MTT法評估hBMP-2對BMSCs的影響。
結(jié)果：(1)PCR獲得長度為1223bp的hBMP-2目的基因片段，同源重組表達載體經(jīng)陽性克隆PCR及測序鑒定，結(jié)果正確。
（2）293細胞內(nèi)包裝、擴增，經(jīng)Western blot及PCR鑒定無誤后，獲得病毒滴度為5x1010pfu/ml的重組腺病毒。
（3）從SD大鼠骨髓提取物中分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)
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