表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的犬2型腺病毒活載體重組疫苗安全評價及免疫效力研究.pdf

1、本研究評價了本實驗室已構(gòu)建的狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重組疫苗(以下簡稱CAV2-E3△-CGS)在環(huán)境釋放階段的生物安全性，進(jìn)行了生產(chǎn)性試驗階段3000條犬的免疫效力研究。 實驗一狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重組疫苗環(huán)境釋放階段安全性評價： 根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》規(guī)定，經(jīng)國家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，在吉林省長春市綠園區(qū)城西鄉(xiāng)紅民村和吉林省松源市寧江區(qū)良種場農(nóng)大分場兩地開展了CAV2-E3△-CGS環(huán)境釋放階段的生

2、物安全評價。500條受試犬，分口服和注射2組免疫；免疫時每條犬注射重組疫苗病毒1ml(10<'7.75> TCID<,50>/ml)或口服3ml(10<'7.75>17CID<,50>/ml)，免疫一次，免疫前及免疫后每周或每隔周采血，分別測定如下指標(biāo)：①重組疫苗在細(xì)胞中和犬體內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性，及其在犬體內(nèi)其它寄生菌中的轉(zhuǎn)移情況；②重組病毒在體內(nèi)的分布、存留時間和免疫犬后的排泄規(guī)律：③高倍劑量接種重組疫苗后對受試犬的影響；④重組疫苗生產(chǎn)人

3、員和試驗人員體內(nèi)犬腺病毒特異性抗體檢測；⑤試驗區(qū)周圍動物體內(nèi)犬腺病毒特異性抗體檢測⑥試驗期間和試驗結(jié)束后6個月內(nèi)，監(jiān)測試驗所在環(huán)境中(糞、尿、土、水等)外源基因的存留情況；⑦疫苗在靶動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平及消長規(guī)律。 結(jié)果顯示，CAV2-E3△-CGS的基本生物學(xué)特性與受體微生物(CAV．2-YCA-18株)一致。遺傳穩(wěn)定性檢測表明，本疫苗在體外傳代79次和體內(nèi)傳代11次后，重組病毒的核酸序列和生物特性未發(fā)現(xiàn)改變。PCR方法

4、檢測從受試犬口腔、鼻腔、肺部和腸道中分離到的寄生菌，未發(fā)現(xiàn)重組病毒特異性基因組序列。經(jīng)組織切片觀察和免疫組化檢測免疫犬的組織，未發(fā)現(xiàn)異常病理學(xué)變化，也未檢測到重組腺病毒或目的抗原在犬體內(nèi)的分布，但病毒分離和PCR檢測結(jié)果顯示，重組病毒在受試犬大腸和小腸中短暫存留，在犬糞便中短期內(nèi)也能檢測到重組病毒的存在。高倍劑量的CAV2-E3△-CGS對受試犬無急性、亞急性和慢性毒性作用，無致畸作用，子代犬發(fā)育正常。重組疫苗生產(chǎn)人員和試驗人員體內(nèi)未檢

5、測出犬腺病毒特異性抗體。試驗區(qū)周圍絕大多數(shù)動物體內(nèi)未檢測到犬腺病毒特異性抗體，個別犬由于自然感染犬腺病毒野毒株而帶有低水平的犬腺病毒抗體(但無狂犬病抗體)。免疫犬后每周采集試驗區(qū)域內(nèi)有代表性地點(diǎn)的非受試動物糞便、水樣及土壤樣品，以PCR法檢測重組腺病毒載體及外源基因的特異性核酸序列，對其中陽性樣品進(jìn)行病毒的分離鑒定。所有采集樣品均未擴(kuò)增獲得重組腺病毒載體及外源基因的特異性核酸序列。CAV2-E3△-CGS誘導(dǎo)的抗體平均水平在國際最低保護(hù)

6、水平(0.5IU/ml)以上，抗體持續(xù)時間至少為54周。 實驗二狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重組疫苗生產(chǎn)性實驗階段免疫效力研究： 根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》有關(guān)規(guī)定，我們又在吉林省長春市綠園區(qū)城西鄉(xiāng)紅民村和吉林省松源市寧江區(qū)良種場農(nóng)大分場兩地開展了CAV2-E3△-CGS的免疫效果研究。試驗中共免疫犬3000條，分2組即口服組和肌肉注射組；免疫時每條犬肌肉注射1ml(10<'7.75> TCID<,50>/ml

7、)或口服3ml(10<'7.75>TCID<,50>/ml)，免疫一次，免疫前及免疫后每周或每隔周對2～5％的免疫犬進(jìn)行了采血抽檢。進(jìn)行了如下試驗：熒光抗體病毒中和試驗測定抗體中和效價；HI檢測腺病毒抗體血凝抑制效價；淋巴細(xì)胞增殖試驗檢測細(xì)胞免疫水平；Western-blot分析抗體組成。 結(jié)果顯示，CAV2-E3△-CGS在犬體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高的針對狂犬病病毒和腺病毒的兩種特異性抗體，并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。CAV2-E