人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量檢測試劑的研制及應用.pdf

1、研究背景及目的:狂犬病病毒（RV）屬于彈狀病毒科，狂犬病病毒屬，形態(tài)呈子彈狀，長180 nm，直徑75 nm，其頭部為半球形，末端常為平端，病毒顆粒由外殼和核心兩部分組成。其基因組由11928～11932個核苷酸組成，為單鏈、不分節(jié)段的負鏈RNA，含5個大的開放閱讀框，編碼5種結構蛋自?；蚪M從3'端至5'端的排列順序為N、P、M、G和L基因，分別編碼病毒核蛋白(NP)、磷蛋白(NS)、膜基質蛋白(MP)、糖蛋白(GP)和轉錄大蛋白(L

2、P)。
　　 近年來的研究表明，狂犬病毒疫苗誘導機體產生中和抗體的免疫應答反應主要與核蛋白和糖蛋白有關。
　　 核蛋白在病毒顆粒中數(shù)量眾多，占病毒蛋白總量的36％。核蛋白基因序列相對恒定，點突變較少，不同株系的同源性在98％～99.6％，是病毒中最穩(wěn)定的蛋白，可用作檢測抗原，也是狂犬病病毒基因分型的主要依據(jù)。核蛋白能誘導保護性免疫。它是一種能誘導對不同型狂犬病病毒產生交叉保護的T輔助細胞(Th)抗原，蛋白的21～35區(qū)域

3、、394～408區(qū)域、404～418區(qū)域是主要的Th細胞表位。狂犬疫苗接種后，人外周血分離到的狂犬特異性的反應T細胞要比其它疫苗接種后分離到的特異性T細胞數(shù)量多，在這些特異性反應T細胞中，多數(shù)是Th細胞，它們絕大多數(shù)表現(xiàn)對核蛋白特異性反應，提示核蛋白是誘導狂犬病細胞免疫的主要成分。此外，核蛋白還能促進中和抗體的產生。把NP加福氏完全佐劑初免小鼠后，用滅活狂犬病毒加強，中和抗體水平明顯上升，而用GP加強，中和抗體產生不明顯。NP抗體還能抑

4、制狂犬病毒在細胞間的傳播和在細胞內的繁殖。因此，核蛋白是狂犬病毒疫苗組分中不可缺少的成分之一，是評價疫苗活力的一個重要指標。
　　 GP是狂犬病毒中唯一能刺激機體產生中和抗體的抗原，其抗原性的保持主要依賴于其空間構象?？袢《綠P的結構特點與其抗原性和免疫原性密切相關，它在刺激機體產生免疫應答的過程中發(fā)揮重要作用。GP是狂犬病毒的主要保護性抗原。具有B、T細胞識別位點，能夠誘導機體發(fā)生細胞和體液免疫應答，刺激機體分泌中和抗體。因

5、此，糖蛋白羧基末端是否缺失及其主要抗原位點空間構象是否被破壞或缺失是衡量狂犬疫苗抗原活力好壞的另一個關鍵性指標。
　　 狂犬病毒核蛋白、糖蛋白含量是狂犬病疫苗的主要質量指標，在精制狂犬病疫苗的研制過程中常需要及時進行抗原含量的檢測，多年來一直用NIH動物法測定。該方法測定周期長，操作繁瑣，以及國際動物保護協(xié)會對實驗動物使用的制約，不適用于提純過程中各步驟的監(jiān)測。因此，尋求可靠的體外檢測狂犬病毒疫苗效力的實驗方法來替代NIH法勢在

6、必行。
　　 本研究采用時間分辨免疫熒光分析（TRFIA）技術研制人用狂犬病毒N蛋白、G蛋白定量檢測試劑，評價各項性能指標，并與其它檢測試劑盒進行比較，評價其在臨床檢測應用中的可行性。時間分辨免疫熒光分析(TRFIA)是以稀土離子標記抗原或抗體、核酸探針和細胞等為特征的新型的非放射性免疫標記技術，它克服了ELISA酶標記物的不穩(wěn)定、O.D值僅在低濃度范圍與酶活性呈線性關系，Hook效應嚴重、酶的活性容易失活，靈敏度不高等缺點，使

7、非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到極高的信噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達到的靈敏度，且還具有標記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優(yōu)點，成為繼放射免疫分析之后標記物發(fā)展的一個新里程碑，已成為生物醫(yī)學研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發(fā)展前景的分析手段，有望未來實現(xiàn)代替NIH法為檢測狂犬疫苗效力。
　　 方法:采用雙抗體夾心法研制人

8、用狂犬病毒核蛋白定量檢測試劑，評價各項性能指標;采用雜交瘤融合法制備狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體。
　　 1.人用狂犬病毒N蛋白定量檢測試劑的研制與應用
　　 1.1狂犬病毒N蛋白抗原的制備:根據(jù)狂犬病病毒CTN株N基因序列設計引物，提取狂犬病毒CTN株疫苗總RNA，采用AMV酶逆轉錄獲得cDNA，利用PCR的方法從cDNA中擴增N基因，將該基因片段定向克隆到原核表達載體p ET32a(+)中，構建原核表達載體p ET32a

9、/N。陽性重組質粒轉化原核表達宿主菌BL21(DE3)，用IPTG誘導表達并確定表達N基因的最佳誘導時間。SDS-PAGE和Western-blot對表達產物進行檢測和分析。
　　 1.2人用狂犬病毒抗N蛋白單克隆抗體的制備:以狂犬病毒全蛋白為抗原免疫Bal/C小鼠，效價達到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，再NP抗原對抗體進行篩選，篩出14株抗NP單抗。
　　 1.3人用狂犬病毒抗N蛋白單克隆抗體的

10、純化:用Protein G Sepharose4 Fastflow親和層析柱純化，并用BCA試劑盒測抗體濃度。
　　 1.4銪標記抗體與純化:將抗N蛋白抗體分別取0.5 mg加入50 KD的蛋白超濾離心柱中，9000 r/min離心8 min。再用標記緩沖液(50 mmol/L，Na2CO3，pH9.0)重復洗滌6次。將200μl標記抗體和50μg銪標記試劑充分混勻，25℃振蕩過夜。標記完成后加入蛋白超濾離心柱中，9000 r/

11、min離心8min。再用洗脫液(含0.9％ NaCl的50 mmol/L Tris-HCl)重復洗脫6次，棄濾液，最后再加入500μl洗脫液，靜置2min后，倒扣9000 r/min離心5 min，收集濾液。
　　 1.5單抗配對篩選:先用狂犬病毒原液作為雙抗夾心的標準品，將14株抗NP單抗一一包被，與另外13株銪標配對，繪制標準曲線，篩出配對得上的單抗，再用自制NP和企業(yè)標準品作為標準品，從中繪制標準曲線，最終篩出配對得上的單

12、抗。
　　 1.6試劑盒性能指標考核:準確性測試（稀釋回收率）、線性范圍的檢測、靈敏度（最低檢測量）、精密度測試、穩(wěn)定性測試、自制試劑與其他試劑比較。
　　 1.6.1準確性測試（稀釋回收率）:將樣品1、樣品2、樣品3分別按1∶200，1∶400，1∶800和1∶1600倍比稀釋，每次試驗作3復孔，重復測定3次，n=3×3，計算其測定值、真實值、標準差和回收率。
　　 1.6.2線性范圍的檢測:將參考標準品抗原稀

13、釋成不同濃度進行測定。每一濃度測試值作3復孔，測試3次，n=3×3，計算試驗的測定值、真值及其比值，分析線性回歸并計算試驗的相關系數(shù)r。
　　 1.6.3靈敏度（最低檢測量）:以標準品稀釋液作為空白零點(A)當作樣品測量，每次試驗設8復孔，重復3次，n=8×3，計算其均值及標準差。
　　 1.6.4精密度測試:分析內精密度:將企業(yè)標準品A-F點各做10個復孔，計算其均數(shù)、標準差及CV值;分析間精密度:將企業(yè)標準品A-F點

14、由3個不同的技術員來操作，分別各做10個復孔，計算其均數(shù)、標準差及CV值。
　　 1.6.5穩(wěn)定性測試:將自制試劑盒分別置于4℃冰箱半年和37℃7天，對各條件下試劑盒的物理外觀、劑量-反應曲線的線性、準確性、精密度、最低檢出量、特異性等指標進行測定。
　　 1.6.6與武漢研究所狂犬病毒N蛋白ELISA試劑盒測值比較:將自制試劑盒與武漢所ELISA狂犬病毒檢測試劑盒同時進行樣品測定，并計算其相關系數(shù)。
　　 2.

15、人用狂犬病毒G蛋白單克隆抗體的制備:以人用狂犬病毒疫苗免疫Bal/C小鼠，效價達到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，用狂犬病毒原液和GP篩選陽性株，再用實驗室自制NP、人白蛋白對抗體進行反篩，篩出48株抗GP單抗。
　　 結果:成功的將狂犬病毒N蛋白基因克隆到p ET32a(+)原核表達質粒，經PCR、限制性酶切和測序等鑒定，成功構建了p ET32a/N重組原核表達質粒。重組質粒pET32a/N在大腸桿菌中表

16、達出狂犬病毒N蛋白的融合蛋白，分子量約為70kDa，與理論值基本符合，表達產物主要以包涵體的形式存在。重組蛋白經過包涵體洗滌Ni親和層析純化后，純度均達90％以上。用抗His標簽抗體對表達產物進行Western-blot分析，發(fā)現(xiàn)特異性條帶出現(xiàn)在70 kDa處，表明該蛋白確實是所要表達融合蛋白。用純化的狂犬病毒免疫小鼠，三次免疫后效價達到1∶64000，細胞融合制備得14株抗NP單克隆抗體，ELISA酶免結果顯示:自制單克隆抗體能與天然

17、蛋白能發(fā)生特異性反應，說明制備的單抗均為特異性單抗。用時間分辨的方法篩選得到FO23和F022一對配對抗體，并用這對抗體制備狂犬病毒N蛋白試劑盒。NP試劑盒準確度好，線性范圍為5～2500 mEU/ml，靈敏度為1.018mEU/ml，精密度良好，分析內精密度為2.7％～9.3％，分析間精密度為3.5％～12.2％。穩(wěn)定性試驗表明，試劑可以在4℃穩(wěn)定半年，37℃穩(wěn)定7天。與武漢研究所狂犬病毒N蛋白ELISA試劑盒測值比較，本試劑盒檢測所

18、得結果與武漢所N蛋白試劑盒趨于高度一致。用狂犬病毒疫苗免疫Bal/C小鼠，效價達到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，用狂犬病毒原液和GP篩選陽性株，再用實驗室自制NP、人白蛋白對抗體進行反篩，篩出48株抗GP單抗，ELISA酶免結果顯示:自制單克隆抗體能與天然蛋白能發(fā)生特異性反應，說明制備的單抗均為特異性單抗。
　　 結論:以上結果表明，本研究成功地構建了p ET32a/N原核重組表達質粒，并在大腸桿菌中大量