豬偽狂犬病病毒microRNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies, PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)所引起的一種高度接觸性、急性傳染病。PRV屬皰疹病毒科(Herpesviridae)，α皰疹病毒亞科，該病在全球范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近期研究表明，一些皰疹病毒編碼的 miRNA在病毒復(fù)制與調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。MicroRNAs(miRNAs)是一種含有約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 RNA分子，廣泛存在于人類(lèi)

2、及其它各種生物中。它通過(guò)與靶 mRNA特異性的結(jié)合，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平。偽狂犬病毒編碼 miRNA的研究才剛剛起步，因此，對(duì)偽狂犬病毒 miRNA的探討具有重要意義和學(xué)術(shù)價(jià)值。
　　本研究利用 PK-15細(xì)胞培養(yǎng)豬偽狂犬病毒，接毒后在不同時(shí)間階段收集病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，分別提取不同時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)物的總 RNA；變性聚丙乙烯酰胺凝膠分離出18-26nt的小片段 RNA，小 RNA分子兩端先后連

3、接生物接頭后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增后回收 DNA片段；將所獲得 DNA片段與質(zhì)粒載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化工程菌，構(gòu)建豬偽狂犬病病毒miRNA的cDNA文庫(kù)。從陽(yáng)性克隆菌落中隨機(jī)挑取一些克隆，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定克隆的特性并測(cè)序，則得到20個(gè)大小正確的序列，結(jié)合生物信息學(xué)方法初步篩選出 miRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)富集小分子RNA、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增小RNA分子，成功構(gòu)建豬偽狂犬病病毒小分子RNA的 cDNA文庫(kù)。序列分析和偽狂犬病病毒生物信息學(xué)