抗豬偽狂犬病毒卵黃抗體的制備及其保護(hù)效力的研究.pdf

1、豬偽狂犬病在歐美一些發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)根除，在中國(guó)，目前只能通過(guò)疫苗接種進(jìn)行預(yù)防。自2011年末以來(lái)，華北大部分地區(qū)的已接種疫苗的豬場(chǎng)爆發(fā)了偽狂犬病，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且，爆發(fā)偽狂犬病時(shí)沒(méi)有有效的藥物治療該種疾病，因此，研制有效的治療藥物對(duì)于控制豬偽狂犬病的蔓延至關(guān)重要。特異性卵黃抗體(IgY)在控制傳染性的細(xì)菌或病毒疾病方面正受到大量的關(guān)注，相對(duì)于哺乳動(dòng)物的IgG，IgY具有廉價(jià)、方便、高產(chǎn)和生物安全性好等優(yōu)勢(shì)，但是，目前國(guó)內(nèi)外并沒(méi)有

2、應(yīng)用抗豬偽狂犬病IgY的報(bào)道。本課題旨在通過(guò)制備偽狂犬病毒(PRV)滅活疫苗免疫蛋雞來(lái)得到較高水平的抗PRV的卵黃抗體，并對(duì)制備的IgY進(jìn)行體內(nèi)外效果的研究，為今后抗PRV卵黃抗體用于豬偽狂犬病韻治療上提供科學(xué)依據(jù)。本課題主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1抗豬偽狂犬病毒(PRV)卵黃抗體的制備及間接ELISA檢測(cè)方法的建立
　　選取24只40周齡健康的產(chǎn)蛋雞（三黃雞），隨機(jī)分成3組（A，B，C組），每組8只。用制備的滅活疫苗免疫3組

3、雞群，免疫方案為:A組注射生理鹽水，B組使用滅活的PRV Bartha-K61疫苗株與白油佐劑乳化后免疫雞群，C組使用滅活的PRVBartha-K61疫苗株與弗氏佐劑乳化后免疫雞群。首免后間隔4周后進(jìn)行第二次免疫，二免后間隔2周進(jìn)行第三次免疫，共免疫3次，3次免疫接種量分別為1mL，2mL，3mL。收集免疫雞群的雞蛋，無(wú)菌分離蛋黃，采用水稀釋、鹽析和超濾法方法從蛋黃中提取和純化IgY，SDS-PAGE檢測(cè)IgY。用全病毒包被酶標(biāo)板，純化

4、的IgY作為一抗，建立了針對(duì)抗PRV卵黃抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，用方陣滴定法確定各反應(yīng)液的工作濃度及作用時(shí)間，并對(duì)檢測(cè)方法的特異性、敏感性及重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)估。用該方法檢測(cè)3組免疫雞群IgY水平。結(jié)果表明:通過(guò)分離、提取和純化各步驟，每10mL卵黃液可以得到IgY的濃度為4.6mg/mL;抗原最佳包被濃度為1∶100，酶標(biāo)二抗工作濃度為1∶4000，臨界值為0.170-0.200，建立的間接ELISA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)

5、性好;B組和C組都得到了較高水平的IgY，從整體來(lái)看，C組得到的IgY水平比B組要高。
　　2抗PRV卵黃抗體的體內(nèi)外中和試驗(yàn)
　　IgY的毒性試驗(yàn):將IgY倍比稀釋成不同的濃度，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入長(zhǎng)勢(shì)良好的PK-15細(xì)胞，在熒光顯徼鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)情況，結(jié)果顯示:IgY不會(huì)引起PK-15細(xì)胞產(chǎn)生CPE，具有較好的生物安全性。IgY細(xì)胞中和試驗(yàn):將IgY倍比稀釋成不同的濃度，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加

6、入200 TCID50的PRV在37℃中和1h后，再加入長(zhǎng)勢(shì)良好的PK-15細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的病變情況，并提取細(xì)胞中病毒的DNA，用熒光定量PCR測(cè)定細(xì)胞中病毒的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示:IgY對(duì)PK-15細(xì)胞的半數(shù)保護(hù)PD50為0.04，說(shuō)明IgY對(duì)PRV具有較強(qiáng)的中和活性;當(dāng)IgY的濃度為575μg/mL時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組和IgY處理組細(xì)胞中病毒的拷貝數(shù)差異顯著，并且隨著IgY濃度的增加，細(xì)胞中病毒的拷貝數(shù)逐漸降低。IgY小鼠體內(nèi)中和試驗(yàn)

7、:將36只清潔級(jí)(Balb/c)小鼠隨機(jī)分成3組，每組12只。其中，陰性對(duì)照組:每只小鼠腹股溝皮下接種0.2mL生理鹽水;陽(yáng)性對(duì)照組:每只小鼠腹股溝皮下接種0.2mL PRVLA病毒株(TCID50為107);試驗(yàn)組:將濃縮后的IgY(25.8mg/mL)與PRV病毒在37℃中和1h后，腹股溝皮下接種小鼠，0.2mL/只。于小鼠出現(xiàn)臨床癥狀后采取3組小鼠血液，提取血清中DNA，用PCR檢測(cè)小鼠有無(wú)發(fā)生病毒血癥。當(dāng)不再出現(xiàn)小鼠死亡后，分析