白血病干細(xì)胞靶向治療及耐藥逆轉(zhuǎn).pdf

1、白血病治療中的耐藥、復(fù)發(fā)等問題，根本原因在于患者體內(nèi)存在著一群白血病干細(xì)胞(LSC)。LSC在干細(xì)胞中所占比例極少，位于細(xì)胞克隆起始階段，和正常干細(xì)胞一樣能自我更新、具有分化潛能，但卻沒有正常干細(xì)胞的自我調(diào)控能力，在細(xì)胞到達(dá)分化末端前就已停止分化，功能紊亂的LSC大量增殖引發(fā)白血病。LSC95％以上處于G0期，呈休眠狀態(tài)，與目前化療藥物大多針對腫瘤細(xì)胞周期活躍期的作用機制沖突，同時發(fā)現(xiàn)與多藥耐藥密切相關(guān)的mdrl、BCRP和MRP基因在

2、LSC均高表達(dá)，這就揭示了LSC能成功逃逸化療并最終導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的真正原因，也揭示了白血病治療的根本是在保證不損害正常造血干細(xì)胞功能的前提下定向清除患者體內(nèi)的LSC。 基于以上理論本實驗從兩方面展開了針對LSC的治療研究： 1、對LSC表面特異性抗原的研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素3受體α鏈(IL-3Rα鏈)即CD123抗原，是特異識別并結(jié)合白細(xì)胞介素3(IL-3)的關(guān)鍵部位，在急性髓系白血病干細(xì)胞表面高表達(dá)，同時在正常造血干細(xì)

3、胞表面幾乎不表達(dá)，是探索根治急性髓系白血病的重要靶點。 力達(dá)霉素(LDM)是近年發(fā)現(xiàn)的具有強烈抗腫瘤能力的烯二炔類大分子蛋白毒素，由非共價鍵連接的活性發(fā)色團(LDE)和保護發(fā)色團的酸性蛋白(LDP)組成。且對mdrl高表達(dá)的多藥耐藥細(xì)胞株未表現(xiàn)出抗藥性，體內(nèi)毒副作用小。 本實驗將IL-3與力達(dá)霉素酸性保護蛋白融合成IL3-G4S-LDP，研究其在大腸桿菌中的高效表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物與靶細(xì)胞結(jié)合的生物學(xué)活性，為體外組裝活性發(fā)色團

4、后靶向殺傷LSC奠定基礎(chǔ)。實驗采用PCR法擴增IL3和LDP的編碼DNA序列，經(jīng)酶切、連接，克隆至表達(dá)載體pAYZ，轉(zhuǎn)化E.coli 16C9，經(jīng)測序鑒定陽性克隆菌落插入片段可正確編碼849bp的融合蛋白。經(jīng)低磷培養(yǎng)基AP5誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，用CM-FF陽離子柱和抗-Etag親和層析柱純化，蛋白純度達(dá)95％以上，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westem blot鑒定，其表達(dá)形式主要為周質(zhì)腔可溶性蛋白，表達(dá)量約為1mg/l。FACS測定融

5、合蛋白與CD123(+)靶細(xì)胞TF-1的結(jié)合活性，結(jié)合率接近99％。 2、PH Ⅱ-7是本室自主研發(fā)的氧化吲哚類抗腫瘤藥物，最大特點是抑制人多種來源、多種耐藥表型的耐藥腫瘤細(xì)胞生長，其中PH Ⅱ-7下調(diào)耐藥基因sorcin、mdr1的表達(dá)已被證實。這就提示PHⅡ-7很可能同樣下調(diào)MRP的表達(dá)，成為逆轉(zhuǎn)LSC MRP耐藥表型的良藥。且PH Ⅱ-7本身通過改變腫瘤細(xì)胞的周期分布兼具細(xì)胞毒性，具有很好的應(yīng)用前景。 本實驗選用M

6、RP高表達(dá)、其他耐藥基因幾乎不表達(dá)的耐藥腫瘤細(xì)胞株HL60/ADR及其親代細(xì)胞系HL60為研究對象，MTT法檢測PHⅡ-7對阿霉素抗腫瘤活性的協(xié)同作用。HL-60組CDI值為0.7<1，HL-60/ADR組CDI值為0.43<0.7，PHⅡ-7對耐藥腫瘤細(xì)胞的協(xié)同作用顯著。提取不同濃度PHⅡ-7處理不同時間的HL-60和HL-60/ADR細(xì)胞mRNA，RT-PCR法分析PHⅡ-7對MRP基因表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)PHⅡ-7能明顯下調(diào)腫瘤細(xì)

7、胞內(nèi)MRP的表達(dá)水平，二者存在時間和劑量依賴關(guān)系。通過激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察PHⅡ-7處理前后，HL-60和HL-60/ADR細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度，發(fā)現(xiàn)隨著PHⅡ-7作用時間延長，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度明顯提高，至96h時耐藥腫瘤細(xì)胞HL-60/ADR內(nèi)的阿霉素濃度可從未經(jīng)處理時僅為敏感細(xì)胞的22.4％升高到55％。以上結(jié)果充分驗證PHⅡ-7逆轉(zhuǎn)耐藥基因MRP表達(dá)的推測。 LSC的發(fā)現(xiàn)使研究者們認(rèn)識了白血病發(fā)生發(fā)展、耐藥復(fù)發(fā)等