TRAIL逆轉(zhuǎn)白血病骨髓基質(zhì)細胞粘附介導(dǎo)Jurkat細胞耐藥的研究.pdf

1、背景：多藥耐藥(multi-drugresistance，MDR)的產(chǎn)生是腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤治療亟待解決的問題。近來有研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞與周圍微環(huán)境的粘附作用與其耐藥產(chǎn)生有關(guān)，即細胞粘附介導(dǎo)的耐藥(celladhesionmediateddrugresistance，CAM-DR)，且該機制在血液系統(tǒng)腫瘤耐藥機制中起重要作用，使腫瘤細胞初始暴露于細胞毒藥物時即在腫瘤微環(huán)境中受到庇護，最終導(dǎo)致腫瘤細胞殘留和經(jīng)典耐藥發(fā)生。采用

2、自白血病患者分離培養(yǎng)的BMSCs構(gòu)建CAM-DR模型可能較正常骨髓基質(zhì)細胞和基質(zhì)細胞系模型能更好地模擬白血病細胞微環(huán)境。對該模型中耐藥形成機制進行探討，并以此為標(biāo)準(zhǔn)選擇腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)作為逆轉(zhuǎn)CAM-DR的工具，初步探討其逆轉(zhuǎn)CAM-DR的有效性及可行性，為從白血病骨髓微環(huán)境的角度探討耐藥逆轉(zhuǎn)策略提供理論和

3、實驗依據(jù)。 目的：1.用白血病BMSCs構(gòu)建CAM-DR模型，在初步探討該模型中不同微環(huán)境成分對白血病細胞化療藥物敏感性影響的基礎(chǔ)上，主要從凋亡調(diào)控蛋白表達和細胞周期兩方面探討CAM-DR形成的可能機制。2.明確TRAIL逆轉(zhuǎn)CAM-DR的有效性，并探討其逆轉(zhuǎn)CAM-DR的可能機制。3.通過觀察TRAIL對正常造血的影響，初步說明其作為CAM-DR逆轉(zhuǎn)策略的可行性。 方法：1.自白血病患者骨髓分離單個核細胞，培養(yǎng)骨髓基質(zhì)

4、細胞，取對數(shù)生長期基質(zhì)細胞，經(jīng)60Co照射后與Jurkat細胞粘附培養(yǎng)，構(gòu)建CAM-DR模型，通過光鏡、掃描電鏡觀察Jurkat細胞與基質(zhì)細胞間的位相關(guān)系，MTT法測定Jurkat細胞DNR的IC50，DNR作用后流式細胞儀定量Jurkat細胞的凋亡率及細胞內(nèi)藥物蓄積濃度，從形態(tài)及功能方面對CAM-DR模型進行鑒定。2.通過流式細胞儀檢測模型中Jurkat細胞的周期分布，Westernblot檢測主要周期調(diào)控蛋白及凋亡調(diào)控蛋白的變化初步

5、闡述白血病骨髓基質(zhì)細胞粘附介導(dǎo)白血病細胞耐藥的可能機制，并以此為主要標(biāo)準(zhǔn)選擇TRAIL為逆轉(zhuǎn)CAM-DR的工具。3.RT-PCR、免疫熒光法及流式細胞儀檢測基質(zhì)細胞粘附和DNR對Jurkat細胞DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)表達的影響，優(yōu)化DNR協(xié)同TRAIL逆轉(zhuǎn)CAM-DR的條件，通過MTT法測定IC50、流式細胞儀定量凋亡率評價該作用條件下對CAM-DR的逆轉(zhuǎn)效果。4.用流式細胞儀、Westernblot等方

6、法通過觀察TRAIL信號通路主要效應(yīng)分子、主要凋亡調(diào)控蛋白及細胞周期分布等的變化，初步闡述TRAIL逆轉(zhuǎn)CAM-DR的機制。5.分別以免疫熒光、流式細胞儀及集落培養(yǎng)等技術(shù)研究誘騙受體DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)在正常骨髓單個核細胞和基質(zhì)細胞的表達及定位，并觀察TRAIL對這兩種細胞的毒性作用及對基質(zhì)細胞支持骨髓單個核細胞擴增的影響。以基因轉(zhuǎn)移技術(shù)制備GFP標(biāo)記的Jurkat細胞，與正常骨髓單個核細胞混合后經(jīng)

7、TRAIL作用24h，行集落培養(yǎng)，通過觀察熒光集落數(shù)和非熒光集落數(shù)的變化說明TRAIL作用的選擇性，即通過探討TRAIL對正常造血的影響，初步說明TRAIL作為CAM-DR逆轉(zhuǎn)策略的可行性。 結(jié)論：1.Jurkat細胞與白血病BMSCs粘附培養(yǎng)所構(gòu)建的CAM-DR模型能較好地模擬骨髓小粒中白血病細胞與BMSCs的結(jié)構(gòu)、位相關(guān)系，且白血病BMSCs粘附能介導(dǎo)Jurkat對DNR耐藥，但不影響Jurkat細胞內(nèi)DNR的蓄積濃度，說明

8、成功構(gòu)建了CAM-DR模型。2.CAM-DR模型中的Jurkat細胞-BMSCs相互作用，ECM和細胞因子等微環(huán)境成分均參與了細胞粘附介導(dǎo)耐藥的形成，且彼此間相互影響、密不可分的。3.BMSCs粘附可上調(diào)Jurkat細胞Bcl-2、XIAP及胞漿c-FLIPL的表達，同時伴有survivin表達的下調(diào)，即CAM-DR與抗凋亡因子/凋亡因子表達失衡有關(guān)。此外，細胞周期G1期阻滯可能也參與了CAM-DR的形成。4.DNR能上調(diào)CAM-DR模

9、型中Jurkat細胞死亡受體DR5表達，下調(diào)XIAP及survivin的表達，并使分裂前期的細胞比例明顯升高，從而發(fā)揮其與TRAIL的協(xié)同效應(yīng)。5.BMSCs粘附可部分抑制TRAIL誘導(dǎo)凋亡的線粒體通路，但TRAIL與DNR的協(xié)同效應(yīng)又能在很大程度上抵消該抑制效應(yīng)，且TRAIL同時還能通過非線粒體途徑直接活化caspase-3等下游效應(yīng)分子而誘導(dǎo)凋亡。因此，TRAIL能有效逆轉(zhuǎn)CAM-DR。6.TRAIL能選擇性地清除Jurkat細胞而