解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)白血病細胞耐藥株HL60-VCR耐藥機制的研究.pdf

1、目的:本實驗用解毒化瘀方（山慈菇、青黛、虎杖、蚤休、莪術(shù)、丹參、川芎、補骨脂）制備成含藥兔血清后，對白血病細胞耐藥株HL60/VCR進行處理。通過觀察白血病細胞耐藥株HL60/VCR中多藥耐藥基因P-gp及凋亡抑制基因Bcl-2的表達，探討解毒化瘀方對白血病細胞耐藥株HL60/VCR多藥耐藥現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)機制。
　　方法:(1)細胞培養(yǎng):分別將白血病細胞株HL60及白血病細胞耐藥株HL60/VCR接種于含10％胎牛血清的RPMI164

2、0培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，2-3天傳代一次，更換細胞液。
　　(2)用MTT法分別檢測長春新堿VCR對自血病細胞株HL60和白血病細胞耐藥株HL60/VCR這兩種細胞的殺傷毒性，從而計算出白血病細胞耐藥株HL60/VCR的耐藥倍數(shù)。
　　(3)用免疫組化法對解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR進行蘇木伊紅染色后，觀察其顯色，判斷白血病細胞耐藥株HL60/VCR中多藥耐藥

3、基因P-gp的表達。
　　(4)用流式細胞術(shù)對解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR進行熒光標(biāo)記檢測，觀察結(jié)果判斷白血病細胞耐藥株HL60/VCR中凋亡抑制基因Bcl-2的表達。
　　結(jié)果:(1)白血病細胞耐藥株HL60/VCR耐藥倍數(shù):在白血病細胞株HL60、白血病細胞耐藥株HL60/VCR的培養(yǎng)液中分別加入2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L濃度梯度的長春新堿培養(yǎng)72小時后，自動酶標(biāo)儀檢測

4、白血病細胞株HL60的IC50濃度OD值為33.127umol/L，而白血病細胞耐藥株HL60/VCR的IC50濃度OD值為149.001umol/L，求得白血病細胞耐藥株HL60/VCR的耐藥倍數(shù)為4.5倍。
　　(2)用免疫組化法蘇木伊紅染色經(jīng)解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR進行檢測，多藥耐藥基因P-gp在白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的表達:經(jīng)免疫組化蘇木伊紅染色后的白血病細胞株HL60著色較淺

5、。而未加藥的白血病細胞耐藥株HL60/VCR著色較深，呈玫瑰紅色。干擾素處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR著色變淺，干擾素加解毒化瘀方含藥血清處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR著色較干擾素處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR著色更淺。低中高三個劑量組解毒化瘀方含藥兔血清分別單獨作用于白血病細胞耐藥株HL60/VCR后，其著色均有不同程度的變淺，且劑量越大顏色越淺，低劑量著色相對最深，高劑量著色相對最淺，說明低劑量組的多藥耐藥基

6、因P-gp的表達相對最高，高劑量相對最低。因此解毒化瘀方含藥兔血清能降低白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的多藥耐藥基因P-gp的表達。
　　(3)用熒光標(biāo)記的流式細胞術(shù)對解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR進行檢測，凋亡抑制基因Bcl-2在白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的表達:經(jīng)熒光標(biāo)記的流式細胞術(shù)處理后檢測發(fā)現(xiàn)白血病細胞株HL60中的凋亡抑制基因Bcl-2呈低表達。而未加藥的白血病細胞耐藥株HL60/

7、VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達明顯偏高。干擾素處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達降低，干擾素加解毒化瘀方含藥血清處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達較干擾素處理的白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達更低。低中高三個劑量組解毒化瘀方含藥兔血清分別單獨作用于白血病細胞耐藥株HL60/VCR后，其凋亡抑制基因Bcl-2的表達均有不同程度的

8、降低，且劑量越大降低的越多，低劑量組表達相對最高，高劑量組相對最低，因此解毒化瘀方含藥兔血清能降低白血病細胞耐藥株HL60/VCR中凋亡抑制基因Bcl-2的表達，且可能與劑量呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:(1)解毒化瘀方含藥兔血清能夠降低多藥耐藥基因P-gp在白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的表達。
　　(2)解毒化瘀方含藥兔血清能夠降低凋亡抑制基因Bcl-2在白血病細胞耐藥株HL60/VCR中的表達。
　　(3)解毒化瘀方