小檗堿在兒童耐藥急性淋巴細(xì)胞白血病靶向治療中的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 小檗堿誘導(dǎo)兒童p53基因缺失白血病細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：腫瘤細(xì)胞耐藥多由于p53基因異常所致，小檗堿能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡。本研究主要探討小檗堿對(duì)兒童p53基因缺失的急性淋巴細(xì)胞白血病EU-4細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用及其作用靶點(diǎn)。
　　方法：選取p53基因缺失的EU-4細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體如下：
　　（1）終濃度為0、1、10、50、100μm

2、ol/L小檗堿作用EU-4細(xì)胞72h，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞，免疫印跡方法（Western Blot）檢測(cè)Bcl-2基因家族蛋白（Bax和Bcl-xl）及X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）的表達(dá)，比色法檢測(cè)Caspase-3的活性變化；
　?。?）終濃度為100μmol/L小檗堿分別作用EU-4細(xì)胞0、24、48、72h，Western Blot檢測(cè)PARP、Caspase-3及XI

3、AP蛋白表達(dá)；
　?。?）終濃度為50μmol/L Z-VAD-FMK預(yù)處理EU-4細(xì)胞30min，使用流式細(xì)胞儀觀察小檗堿誘導(dǎo)EU-4細(xì)胞凋亡的變化；
　?。?）終濃度為0、0.1、0.5、1.0μmol/L阿霉素作用EU-4細(xì)胞48h，Western Blot檢測(cè)鼠雙微粒體2（MDM2）和XIAP蛋白的變化；
　?。?）使用小干擾RNA（siRNA）或小檗堿下調(diào)XIAP蛋白的表達(dá)，觀察單純降低XIAP表達(dá)或者聯(lián)合阿

4、霉素對(duì)于EU-4細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：（1）小檗堿作用EU-4細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），并呈濃度依賴關(guān)系，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)變化；
　?。?）小檗堿誘導(dǎo)EU-4細(xì)胞凋亡主要依賴Caspase的活性，并且Caspase-3的活性顯著增強(qiáng)（P<0.05）；
　　（3）小檗堿以濃度和時(shí)間依賴的方式下調(diào)XIAP蛋白的表達(dá)；
　　（4）阿霉素?zé)o明顯誘導(dǎo)EU-4細(xì)胞凋亡的作用，MDM2及XIAP

5、蛋白表達(dá)亦無(wú)明顯變化；
　　（5）單純下調(diào)XIAP蛋白的表達(dá)引起EU-4細(xì)胞明顯凋亡，與阿霉素共同作用后還能夠增強(qiáng)EU-4細(xì)胞對(duì)于阿霉素的敏感性（P<0.05）。
　　結(jié)論：小檗堿能夠以不依賴p53的方式誘導(dǎo)白血病EU-4細(xì)胞凋亡，XIAP作為小檗堿的作用靶點(diǎn)，參與了EU-4細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分 小檗堿調(diào)控白血病細(xì)胞X連鎖凋亡抑制蛋白表達(dá)的機(jī)制研究
　　目的：小檗堿能夠以X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）為作用

6、靶點(diǎn)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。本研究主要探討小檗堿調(diào)控兒童急性淋巴細(xì)胞白血病EU-4細(xì)胞中XIAP蛋白表達(dá)的具體分子機(jī)制。
　　方法：（1）終濃度為100μmol/L小檗堿分別作用EU-4細(xì)胞0、24、48、72h，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)XIAP mRNA變化；放線菌素D實(shí)驗(yàn)觀察小檗堿對(duì)于XIAP mRNA穩(wěn)定性的影響；
　?。?）終濃度為0、1、10、50、100μmol/L小檗堿作用EU-4細(xì)胞72h，免疫印跡方法（W

7、estern Blot）檢測(cè)細(xì)胞中鼠雙微粒體2（MDM2）及磷酸化MDM2蛋白量以及亞細(xì)胞定位的變化；終濃度為100μmol/L小檗堿分別作用EU-4細(xì)胞0、24、48、72h，PCR檢測(cè)MDM2 mRNA變化；
　?。?）使用小干擾RNA（siRNA）下調(diào)EU-4細(xì)胞中MDM2蛋白的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)降低MDM2表達(dá)對(duì)于XIAP蛋白的影響；
　　（4）采用放線菌酮實(shí)驗(yàn)觀察小檗堿對(duì)于XIAP蛋白穩(wěn)定性的影響，

8、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小檗堿對(duì)于XIAP蛋白泛素化的影響。
　　結(jié)果：（1）小檗堿不影響XIAP mRNA表達(dá)量及其穩(wěn)定性；
　?。?）小檗堿以濃度和時(shí)間依賴的方式下調(diào)MDM2蛋白表達(dá)，并且該調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，小檗堿能夠降低胞漿中MDM2蛋白水平；
　?。?）siRNA下調(diào)MDM2表達(dá)以后引起XIAP蛋白表達(dá)的降低；
　?。?）小檗堿增高XIAP蛋白自身的泛素化水平，降低XIAP蛋白的穩(wěn)定性，使其通過(guò)泛素-蛋白