靶向白血病干細胞新單抗3A4的人源化研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　白血病居小兒惡性腫瘤發(fā)病和死亡的首位。目前在中國有200多萬的白血病患兒，且新發(fā)病例在不斷增加。雖然近年來不斷優(yōu)化治療方案，但仍有部分患兒治療失敗。其中白血病干細胞(leukemia stem cell，LSC)的殘留被認為是白血病耐藥和復發(fā)的根源。單克隆抗體（單抗）導向的免疫治療因其對靶細胞具有高度特異性和有效殺傷性而成為目前研究的熱點。如果能找到靶向LSC的新單抗，則白血病的治療和預后將會有新的突破。

2、r>　　CD45RA在髓系和B系惡性血液病細胞及LSC上高表達，而在中性粒細胞、血小板、紅細胞及記憶T細胞上不表達，故CD45RA可作為殺傷LSC的一個良好靶點。
　　本實驗室前期已成功研制抗人CD45RA的鼠單抗3A4及人鼠嵌合抗體scFv3A4-Fc，然而鼠及人鼠嵌合抗體作為異種抗原易引發(fā)人抗鼠抗體或人抗嵌合抗體反應。為了進一步降低鼠源抗體的免疫原性，需要對其Fab段也進行人源化改造。由于用傳統(tǒng)方法篩選人源化抗體費時費力，故本

3、研究的目的包括獲取高親和力人源化抗體Hu3A4，同時積極探索出一種簡便快捷地進行人源化抗體篩選的新方法。另外，探索構(gòu)建新的免疫毒素以增強抗體的靶向殺傷特性也是本研究的目的之一。
　　本研究包括三個部分:1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO細胞中的表達及功能研究;2.高親和力人源化抗體的篩選及功能研究;3.人鼠嵌合抗體免疫毒素(scFv3A4-FcRap)的制備及活性研究。
　　

4、方法：
　　1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO細胞中的表達及功能研究
　　1.1 scFv3A4-EGFP融合蛋白真核表達載體的構(gòu)建
　　設計包含酶切位點的引物，擴增EGFP基因，將該基因插入pcDNA3.1(+)真核表達載體中構(gòu)建pcDNA3.1/EGFP質(zhì)粒，然后酶切替換pHMCH3/scFv3A4-Fc中Fc段從而構(gòu)建出pHMCH3/scFv3A4-EGFP真核表

5、達載體。
　　1.2 scFv3A4-EGFP融合蛋白的表達和活性檢測
　　1)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，以pHMCH3/scFv3A4-EGFP轉(zhuǎn)染CHO細胞，轉(zhuǎn)染后24小時G418加壓篩選。
　　2)加壓篩選14天左右，RT-PCR，細胞免疫熒光，流式細胞儀分析法檢測陽性克隆。
　　3)對陽性克隆進行單克隆化，熒光顯微鏡觀察法篩選出穩(wěn)定表達細胞株，命名為CHO/scFv3A4-EGFP，同時用RT-PCR方法探索

6、亞克隆出現(xiàn)假陰性原因。
　　4)收集上清，Ni-IDA親和層析法純化scFv3A4-EGFP融合蛋白，BCA法測定融合蛋白濃度。
　　5) SDS-PAGE和Western-Blot檢測細胞培養(yǎng)上清中scFv3A4-EGFP融合蛋白的表達，并確定分子量大小。
　　6)滴定實驗初步了解scFv3A4-EGFP融合蛋白的親和力。
　　7)抗體阻滯實驗和細胞表達譜研究確定scFv3A4-EGFP融合蛋白抗原識別特異性。

7、
　　8)細胞免疫熒光法和BFA阻滯法確定scFv3A4-EGFP融合蛋白在CHO細胞中的分泌途徑。
　　9)熒光淬滅法以了解scFv3A4-EGFP融合蛋白的光穩(wěn)定性。
　　2.高親和力人源化抗體的篩選及功能研究
　　2.1人源化抗體的理論設計及其真核表達載體的構(gòu)建
　　1)人源化抗體的設計。首先將3A4的V及VL基因與人抗體庫基因序列進行比對以確定人源化FR模板，將3A4的CDR植入該模板中構(gòu)建人源化3

8、A4VHa及3A4VLa基因。用Discovery Studio2.5軟件模擬3A4的三維結(jié)構(gòu)并確定關(guān)鍵氨基酸殘基位置，構(gòu)建回復突變的人源化3A4VHb及3A4VLb基因。
　　2)人源化抗體真核表達載體的構(gòu)建。為利于scFv-Fc形式蛋白的純化，通過PCR方法擴增pHMCH3/scFv3A4-Fc質(zhì)粒中Fc段，從而將6xHis標簽引入，構(gòu)建新的scFv3A4-FcHis真核表達載體。全基因合成3A4VHa、3A4VLa、3A4V

9、Hb及3A4VLb基因。通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)方法構(gòu)建pGEM-T/scFv3A4a及pGEM-T/scFv3A4b質(zhì)粒，然后通過雙酶切構(gòu)建scFv3A4a-FcHis及scFv3A4b-FcHis真核表達載體。為驗證scFv-EGFP融合蛋白可用于人源化抗體篩選，通過酶切方法構(gòu)建scFv3A4a-EGFP及scFv3A4b-EGFP真核表達載體。
　　2.2高親和力人源化抗體的表達與篩選
　　1)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

10、染的方法，以pHMCH3/scFv3A4-FcHis、 pHMCH3/scFv3A4a-FcHis、pHMCH3/scFv3A4b-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-EGFP及pHMCH3/scFv3A4b-EGFP轉(zhuǎn)染CHO細胞，轉(zhuǎn)染后18小時熒光顯微鏡觀察融合蛋白的表達情況，24小時后G418加壓篩選。
　　2)收集轉(zhuǎn)染后24h，48h及72h細胞培養(yǎng)上清，流式細胞儀分析法檢測融合蛋白瞬時表達情況。加壓篩選14天左右

11、，RT-PCR檢測pHMCH3/scFv3A4a-FcHis及pHMCH3/scFv3A4a-EGFP轉(zhuǎn)染細胞株目的基因表達情況。
　　3)通過抗體阻滯實驗和競爭性結(jié)合實驗了解scFv3A4b-FcHis與scFv3A4b-EGFP的抗原識別情況和親和力。
　　2.3完整IgG形式高親和力人源化抗體Hu3A4真核表達載體的構(gòu)建
　　1)構(gòu)建人重鏈恒定區(qū)(CH)及輕鏈恒定區(qū)(CL) TA克隆載體。提取外周血單個核細胞(P

12、BMC)總RNA，PCR法擴增人CH及CL片段，構(gòu)建CH及CLTA克隆載體。
　　2)構(gòu)建人源化重鏈Hu3A4VH-CH真核表達載體
　　雙酶切pGEM-T/CH及pHMCH3/scFv3A4b-FcHis，將目的片段與載體片段連接后構(gòu)建Hu3A4VH-CH真核表達載體。
　　3)構(gòu)建人源化輕鏈Hu3A4VL-CL真核表達載體
　　通過PCR和雙酶切首先構(gòu)建pHMCH3/3A4VLb-FcHis質(zhì)粒，然后雙酶切C

13、LPCR產(chǎn)物及pHMCH3/3A4VLb-FcHis，連接后獲得Hu3A4VL-CL真核表達載體。
　　2.4完整IgG形式高親和力人源化抗體Hu3A4的表達和功能研究
　　1)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pHMCH3/Hu3A4VH-CH及pHMCH3/Hu3A4VL-CL共同轉(zhuǎn)染CHO細胞，轉(zhuǎn)染后24小時G418加壓篩選。
　　2)加壓篩選14天左右，RT-PCR，細胞免疫熒光，流式細胞儀分析法檢測陽性克隆。
　

14、　3)對陽性克隆進行單克隆化，熒光顯微鏡觀察法篩選出穩(wěn)定表達細胞株，命名為CHO/Hu3A4。
　　4)收集上清，SPA親和層析法純化Hu3A4，BCA法測定抗體濃度。
　　5) SDS-PAGE和Western-Blot檢測細胞培養(yǎng)上清中Hu3A4的表達，并確定分子量大小。
　　6)滴定實驗和競爭性結(jié)合實驗了解并比較Hu3A4與scFv3A4b-FcHis的親和力。
　　7)CDC和ADCC實驗了解并比較Hu3

15、A4與scFv3A4b-FcHis對靶細胞的殺傷特性。
　　8)觀察并比較Hu3A4與scFv3A4b-FcHis對白血病小鼠的治療情況。
　　3.人鼠嵌合抗體免疫毒素（scFv3A4-FcRap）的制備及活性研究
　　3.1 scFv3A4-FcRap免疫毒素真核表達載體的構(gòu)建
　　全基因合成Rap基因，通過PCR和雙酶切構(gòu)建scFv3A4-FcRap免疫毒素真核表達載體的構(gòu)建。
　　3.2 scFv3A

16、4-FcRap免疫毒素的表達和功能研究
　　1)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pHMCH3/scFv3A4-FcRap轉(zhuǎn)染CHO細胞，轉(zhuǎn)染后24小時G418加壓篩選。
　　2)加壓篩選14天左右，RT-PCR，細胞免疫熒光，流式細胞儀分析法檢測陽性克隆。
　　3)對陽性克隆進行單克隆化，熒光顯微鏡觀察法篩選出穩(wěn)定表達細胞株，命名為CHO/scFv3A4-FcRap。
　　4)收集上清，Ni-IDA親和層析法純化scFv

17、3A4-FcRap，BCA法測定抗體濃度。
　　5) SDS-PAGE和Western-Blot檢測細胞培養(yǎng)上清中scFv3A4-FcRap的表達，并確定分子量大小。
　　6)滴定實驗和競爭性結(jié)合實驗了解scFv3A4b-FcHis的親和力。
　　7)流式細胞儀檢測scFv3A4-FcRap對靶細胞的直接殺傷作用。
　　8)流式細胞儀檢測scFv3A4-FcRap的內(nèi)化作用。
　　9) CDC和ADCC實驗

18、了解并比較scFv3A4-FcRap與scFv3A4-FcHis對靶細胞的殺傷特性。
　　10)觀察并比較scFv3A4-FcRap與scFv3A4-FcHis對白血病小鼠的治療情況。
　　結(jié)果：
　　1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO細胞中的表達及功能研究:成功構(gòu)建pcDNA3.1/EGFP和pHMCH3/scFv3A4-EGFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細胞，加壓篩選14天左

19、右，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的CHO細胞Cdna可擴增出目的條帶，細胞免疫熒光法檢查可見轉(zhuǎn)染的CHO細胞內(nèi)含有目的蛋白。流式細胞儀分析法在轉(zhuǎn)染CHO細胞培養(yǎng)上清中檢測到有活性的scFv3A4-EGFP融合蛋白，陽性細胞率為85.82％，經(jīng)亞克隆后篩選到穩(wěn)定表達株CHO/scFv3A4-EGFP。對假陰性細胞株進行RT-PCR法證實質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。擴大培養(yǎng)CHO/scFv3A4-EGFP后取上清檢測陽性細胞率可達97％以上。Ni-IDA親和層析

20、法純化scFv3A4-EGFP融合蛋白，BCA法測濃縮純化蛋白為0.135mg/ml，CHO/scFv3A4-EGFP細胞培養(yǎng)上清濃度約為1350μg/L。SDS-PAGE和Western-Blot鑒定scFv3A4-EGFP分子量約57KDa。滴定實驗顯示約0.1μg scFv3A4-EGFP即可飽和1×106KGla細胞?？贵w阻滯實驗和細胞表達譜研究證實scFv3A4-EGFP融合蛋白與親本3A4抗體識別相同的抗原表位。細胞免疫熒光

21、法和BFA阻滯法證實scFv3A4-EGFP融合蛋白在CHO細胞中通過高爾基復合體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑進行分泌。熒光淬滅法證實scFv3A4-EGFP融合蛋白有良好的光穩(wěn)定性。
　　2.高親和力人源化抗體的篩選:根據(jù)人源化比對結(jié)果選擇同源性最高的序列X62106及X86355作為3A4VH人源化模板序列;選擇M23090及AF103571作為3A4VL人源化模板序列。用軟件確定3A4中14個關(guān)鍵氨基酸位點（注:由于相關(guān)位點正準備申請專利故

22、不詳述，請各位專家諒解）。成功構(gòu)建pHMCH3/scFv3A4-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-FcHis、pHMCH3/scFv3A4b-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-EGFP及pHMCH3/scFv3A4b-EGFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細胞18小時后即可用熒光顯微鏡觀察到含EGFP片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞可發(fā)出綠色熒光。流式細胞儀可檢測到轉(zhuǎn)染后24h，48h及72h細胞培養(yǎng)上清中scFv3A4-FcHis、scFv

23、3A4b-FcHis、scFv3A4-EGFP及scFv3A4b-EGFP融合蛋白的表達，且蛋白分泌量隨著時間的增加而增多。加壓篩選14天左右，RT-PCR檢測pHMCH3/scFv3A4a-FcHis及pHMCH3/scFv3A4a-EGFP轉(zhuǎn)染的CHO細胞cDNA可擴增出目的條帶?？贵w阻滯實驗證實scFv3A4b-FcHis與scFv3A4b-EGFP識別相同的抗原表位，而競爭性結(jié)合實驗表明scFv3A4b-FcHis與scFv3A

24、4b-EGFP有相近的親和力。
　　3.完整IgG形式高親和力人源化抗體Hu3A4的制備及功能研究:成功構(gòu)建pHMCH3/Hu3A4VH-CH和pHMCH3/Hu3A4VL-CL質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細胞，加壓篩選14天左右，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的CHO細胞cDNA可擴增出目的條帶，細胞免疫熒光法檢查可見轉(zhuǎn)染的CHO細胞內(nèi)含有目的蛋白。經(jīng)亞克隆后篩選到穩(wěn)定表達株CHO/Hu3A4，取上清檢測陽性細胞率可達98％以上。SPA親和層析法純化

25、Hu3A4抗體，BCA法測濃縮純化蛋白為0.25mg/ml，推測CHO/Hu3A4細胞培養(yǎng)上清濃度約為2.50μg/ml。SDS-PAGE和Western-Blot鑒定Hu3A4分子量約160 kDa。滴定實驗顯示約0.5μg Hu3A4或1.0μg的scFv3A4b-FcHis抗體即可飽和1×106KGla細胞。Hu3A4的相對親和力為3.7×1010M-1，而scFv3A4b-FcHis為4.7×109M-1。Hu3A4及scFv3

26、A4b-FcHis的CDC作用均不明顯，而ADCC作用隨效靶比的增高而增強，并且Hu3A4的ADCC作用強于scFv3A4b-FcHis。動物實驗顯示Hu3A4及scFv3A4b-FcHis均可有效治療白血病小鼠。
　　4.scFv3A4-FcRap免疫毒素的制備和功能研究:成功構(gòu)建pHMCH3/scFv3A4-FcRap質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細胞，加壓篩選14天左右，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的CHO細胞cDNA可擴增出目的條帶，細胞免疫熒

27、光法檢查可見轉(zhuǎn)染的CHO細胞內(nèi)含有目的蛋白。經(jīng)亞克隆后篩選到穩(wěn)定表達株CHO/Hu3A4，取上清檢測陽性細胞率可達98％以上。Ni-IDA親和層析法純化scFv3A4-FcRap免疫毒素，BCA法測濃縮純化蛋白為1.5mg/ml，推測CHO/scFv3A4-FcRap細胞培養(yǎng)上清濃度約為4-5μg/ml。 SDS-PAGE和Western-Blot鑒定scFv3A4-FcRap分子量約135 kDa。滴定實驗顯示約0.25μg scFv

28、3A4-FcRap即可飽和1×106KGla細胞。ScFv3A4-FcRap的相對親和力為5.0×1010M-1。 ScFv3A4-FcRap在體外對KGla細胞有一定的直接殺傷作用。ScFv3A4-FcRap及scFv3A4-FcHis的CDC作用均不明顯，而ADCC作用隨效靶比的增高而增強，并且scFv3A4-FcRap的ADCC作用與scFv3A4-FcHis抗體相當。動物實驗顯示scFv3A4-FcRap及scFv3A4-FcH

29、is均可有效治療白血病小鼠。
　　結(jié)論：
　　1、證實CHO細胞可穩(wěn)定地表達和分泌抗CD45RA的scFv3A4-EGFP融合蛋白，該表達系統(tǒng)應該也可以用于其他的scFv-EGFP融合蛋白的表達。
　　2、開發(fā)了一種新的方法（構(gòu)建人源化scFv-EGFP融合蛋白）以加快抗體的人源化篩選過程。該方法結(jié)合計算機分子模擬技術(shù)可顯著縮短治療性抗體的開發(fā)時間。
　　3、成功構(gòu)建并獲得3A4的兩種形式人源化抗體scFv3A4