抗體介導(dǎo)的siRNA靶向運輸并抑制漢坦病毒復(fù)制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、漢坦病毒是脂質(zhì)被膜包裹的RNA病毒,可以持續(xù)感染嚙齒類動物卻不使其致病,而人在吸入含有病毒的氣溶膠狀的嚙齒動物排泄物后可以被感染,引起腎綜合征出血熱(HFRS)和肺綜合征(HPS)。目前,還沒有針對漢坦病毒感染治療的抗病毒藥物,臨床只限于對癥和支持治療。因此,尋找有效和特異的治療漢坦病毒的新方法顯得十分重要而迫切。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的序列特異性的基因沉默機制。以致病基因為靶點的RNAi技術(shù),可用于治療包括腫瘤、

2、感染性疾病和遺傳病在內(nèi)的各種疾病。抗病毒RNAi策略作為治療方法的應(yīng)用研究正備受關(guān)注,有多種基于該策略的方案正在進行臨床試驗。然而,盡管針對病毒基因的RNAi能夠特異性地抑制病毒的復(fù)制,但小RNA的組織或細胞特異性轉(zhuǎn)運卻絕非簡單易行。治療性小干擾RNAs(siRNAs)面臨著如何在體內(nèi)被特異和有效地轉(zhuǎn)運到靶細胞的難題。研究結(jié)果提示,體內(nèi)細胞類型特異性的基因沉默可以通過siRNA與細胞類型特異性親和配體或單克隆抗體結(jié)合而得以實現(xiàn),即抗體指

3、導(dǎo)的siRNA復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進入靶細胞,隨后釋放到細胞漿,通過RNAi路徑,特異性地沉默靶基因的表達。與小分子堿性核酸結(jié)合蛋白融合的抗體片段是一種體內(nèi)轉(zhuǎn)運的有效工具,體內(nèi)基因沉默的特異性、不引發(fā)非特異性免疫激活和全身毒性等特點促進了以治療性RNAi的細胞類型特異性轉(zhuǎn)運為基礎(chǔ)的治療方法的開發(fā)。
  本研究針對漢坦病毒76-118株的編碼基因,以隨機序列siRNA為陰性對照,設(shè)計合成了4種siRNAs,篩選出抗病毒效果最強的siR

4、NA-HV2(命名為siHV)用于下一步研究。為確定抗體介導(dǎo)的siRNA是否可以特異性地將siRNA轉(zhuǎn)運入漢坦病毒感染的細胞,在原核表達載體pET32a中表達了一種融合蛋白3G1scFv-C_K-tP,它由漢坦病毒抗原特異性單鏈抗體(3G1scFv)與魚精蛋白片段(第8-29位氨基酸)通過人C_K連接而形成。誘導(dǎo)表達的此融合蛋白以可溶性表達為主,此融合蛋白明顯保留有抗原結(jié)合活性,可以特異地結(jié)合胞膜上的病毒抗原,與細胞表面的抗原結(jié)合后可以

5、特異性地內(nèi)化入感染細胞的胞漿,且與轉(zhuǎn)鐵蛋白有相似的內(nèi)化路徑,即通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞來實現(xiàn)的。此融合蛋白可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運siRNAs到漢坦病毒感染的細胞。先后用凝膠遷移阻滯實驗和流式細胞儀進行檢測,結(jié)果表明:3G1scFv-C_K-tP具有與siRNA結(jié)合的能力,且這種結(jié)合能力存在著劑量依賴關(guān)系;DynabeadsTALON磁珠分析顯示3G1scFv-C_K-tP與siRNA之間量的結(jié)合關(guān)系為1分子3G1scFv-C_K-tP可以結(jié)合約1

6、0分子siRNA;3G1scFv-C_K-tP可以將FITC-siRNA特異性地運送到病毒感染的細胞。采用MTT方法測定細胞生長曲線,表明3G1scFv-C_K-tP/siRNA對細胞生長沒有毒性作用。在感染細胞中,此融合蛋白靶向轉(zhuǎn)運siHV能夠有效地抑制病毒的復(fù)制。結(jié)果表明:3G1scFv-C_K-tP/siHV降低了病毒RNA和病毒抗原的水平,而且下降程度與siRNA呈劑量依賴性。在乳鼠顱內(nèi)注射漢坦病毒76-118株以制備動物模型,

7、然后腹腔注射3G1scFv-C_K-tP/FITC-siRNA混合物,證實此融合蛋白能夠特異地將siRNA轉(zhuǎn)運入漢坦病毒感染的腦細胞。流式細胞儀檢測顯示3G1scFv-C_K-tP可以特異性的將FITC-siRNA轉(zhuǎn)運到漢坦病毒感染的腦組織,且熒光顯微鏡下可見熒光陽性細胞、高倍鏡下觀察到熒光彌散分布在漢坦病毒感染細胞的細胞膜和細胞漿。腹腔注射3G1scFv-C_K-tP/siHV可以用于漢坦病毒感染性腦炎的保護。結(jié)果顯示3G1scFv-

8、C_K-tP/siHV治療組中病毒RNA和病毒抗原的水平明顯降低;將腦組織和其它組織分別進行免疫組織化學(xué)染色,觀察到3G1scFv-C_K-tP/siHV使?jié)h坦病毒的感染和復(fù)制受到了明顯抑制;對動物的生存率進行評估,發(fā)現(xiàn)3G1scFv-C_K-tP轉(zhuǎn)運的siHV對動物有明顯的保護作用;檢測乳鼠體內(nèi)IFN水平,顯示3G1scFv-C_K-tP/siHV并未誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生,證明在動物體內(nèi)產(chǎn)生的保護作用是由針對病毒RNA的特異性RNAi所介

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