丹酚酸B對凍融人胎兒卵巢原始卵泡體外發(fā)育影響的實驗研究.pdf

1、目的： 醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步使許多年輕癌癥患者的生存率得到顯著提高，但癌癥治療的放化療過程可能導(dǎo)致女性患者面臨卵巢功能衰竭、生育力喪失的危險。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，恢復(fù)生育能力的方法有胚胎冷凍、卵子冷凍和卵巢組織冷凍。目前而言，凍存卵巢皮質(zhì)是最有效的卵子庫技術(shù)，而如何利用冷凍保存的卵巢皮質(zhì)的原始卵泡，恢復(fù)其內(nèi)分泌和生殖功能是國際醫(yī)學(xué)界的研究熱點。雖然哺乳動物原始卵泡體外生長和成熟的能力已得到證實。但人類卵泡體外成熟的研究尚處于早期階

2、段，迫切需要實質(zhì)性突破和成熟。由于胎兒卵巢組織在取材和培養(yǎng)前后，卵巢組織處于缺血、缺氧的不良環(huán)境中，而組織細胞的體外培養(yǎng)體系又多處于一種高氧壓狀態(tài)，這些都極大的影響著組織細胞的新陳代謝，進而降低細胞增殖速度和生存率，一般認為這種損傷與氧化損傷有關(guān)。氧自由基的增多是卵泡閉鎖的促發(fā)因素之一，而抗氧化劑能顯著地抑制顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖。怎樣減少原始卵泡在體外培養(yǎng)過程中造成的氧化損傷是我們研究的重點。丹酚酸類化合物是從丹參中提取的水溶性成分，

3、具有很強的抗氧化作用。本實驗通過凍融人胎兒卵巢皮質(zhì)片的體外培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用光鏡、免疫組織化學(xué)染色及Realtime RT-PCR等實驗技術(shù)分析丹酚酸B對凍融人胎兒卵巢組織原始卵泡體外發(fā)育的影響，探討丹酚酸B是否通過其抗氧化、抗凋亡功能，減少體外培養(yǎng)過程中氧化損傷所造成的卵泡細胞凋亡和原始卵泡丟失，利于原始卵泡的體外發(fā)育，有效促進人卵巢組織卵泡體外發(fā)育和成熟，為凍融人卵巢組織的臨床應(yīng)用和人卵巢庫的建立提供實驗依據(jù)。 方法：

4、取中晚期引產(chǎn)的4例胎兒卵巢組織塊經(jīng)過玻璃化冷凍、速融后于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天半量換液?；A(chǔ)培養(yǎng)液為α-MEM，含10％HSA、100U/mL的卵泡刺激素(FSH)、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素、1/100 ITS，實驗分組為新鮮組、凍融組、對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組一共為6組。根據(jù)實驗條件分別添加丹酚酸B使其終濃度為3mg/ml、30mg/ml、300mg/ml。分別收集各培養(yǎng)組8小時、24小時

5、、48小時、7天四個時間段的培養(yǎng)物，用于光鏡觀察、透射電鏡觀察、免疫組織化學(xué)、Eva Green Real-Time RT-PCR法檢測。 結(jié)果： 一、人胎兒卵巢組織凍融前后的檢測 1、光學(xué)顯微鏡觀察 新鮮組和凍融組卵巢組織均以原始卵泡為主。新鮮組和凍融組卵泡直徑(33.85μm±2.33 vs34.54μm±2.78)，卵母細胞直徑(29.65μm±1.34 vs29.37μm±1.38)比較均無統(tǒng)計學(xué)

6、意義。 2、PCNA的檢測： 新鮮組和凍融組中分別觀察原始卵泡150個，均未見有PCNA的陽性表達。 3、透射電鏡觀察： 本實驗制作了新鮮組與凍融組卵巢組織共8個電鏡標本并進行了觀察。發(fā)現(xiàn)凍融組卵巢組織中大部分原始卵泡超微結(jié)構(gòu)保存較完整(圖9)。其中卵母細胞保存最好；卵母細胞與顆粒細胞的連接也較好，可見到卵母細胞與顆粒細胞之間的微絨毛結(jié)構(gòu)完好(圖12、13)；卵泡周圍的顆粒細胞保存效果稍差，顆粒細胞與間質(zhì)

7、之間的連接較好(圖14、15)，中度水腫、棘斷裂的線粒體數(shù)量稍較卵母細胞多。大部分間質(zhì)損傷并不嚴重，損傷的間質(zhì)主要表現(xiàn)為局灶性的水腫，除了偶見間質(zhì)細胞胞膜皺縮，其余間質(zhì)細胞基本形態(tài)結(jié)構(gòu)尚保存(圖14、15)。 二、人胎兒卵巢組織體外培養(yǎng)后的檢測 1、光學(xué)顯微鏡觀察： 與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)相比，培養(yǎng)后第7天的對照組、低劑量組、中劑量組與高劑量組的初級卵泡數(shù)明顯增多，原始卵泡數(shù)明顯減少，未見次級及以上級別卵泡

8、。培養(yǎng)后第7天各組卵泡和卵母細胞直徑均有增大；與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)比較，有顯著性差異(P<0.01)；與對照組相比，高劑量組卵泡直徑，卵母細胞直徑增大具統(tǒng)計學(xué)意義。 2、增殖細胞核抗原(PCNA)的檢測： 少數(shù)原始卵泡中可見體積增大的立方形顆粒細胞PCNA的陽性表達。初級卵泡為顆粒細胞和/或卵母細胞的PCNA陽性表達。對照組、低劑量組、中劑量組與高劑量組卵巢間質(zhì)都有PCNA的大量表達。 3、超氧化物歧化酶

9、(SOD)的檢測： 在培養(yǎng)后的胎兒卵巢組織中SOD主要在顆粒細胞與間質(zhì)細胞漿內(nèi)表達，而在顆粒細胞胞漿中表達較強。 4、SOD、BCL-2mRNA的表達： 培養(yǎng)后對照組SODmRNA、BCL-2mRNA表達最低，添加丹酚酸B的各組SODmRNA的表達均比對照組明顯增高。隨著丹酚酸B作用時間的延長SODmRNA、BCL-2mRNA的表達均有所降低。而不同濃度的丹酚酸B作用又有著差異，在體外培養(yǎng)8h時高劑量、中劑量組與

10、對照組相比均有顯著性差異(P>0.05)；而低劑量組與對照組相比有無顯著性差(P>0.05)。24h與48h的結(jié)果顯示高劑量組與對照組有著顯著性差異(P<0.05)，低劑量與中劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1、結(jié)合光鏡和透射電鏡觀察能更全面地評價凍融過程對胎兒卵巢組織的影響。 2、玻璃化冷凍過程對胎兒卵巢組織中的原始卵泡數(shù)量和形態(tài)上均未造成明顯的損傷，而對卵巢間質(zhì)細胞的超微結(jié)構(gòu)保存也較好。結(jié)合增殖

11、細胞抗原(PCNA)的檢測證實了玻璃化冷凍后胎兒卵巢組織在體外培養(yǎng)過程中處于良好的生長狀態(tài)，玻璃化冷凍法適合人胎兒卵巢組織的保存，凍融胎兒卵巢組織能在體外培養(yǎng)條件下進一步生長發(fā)育。 3、丹酚酸B能有效的清除胎兒卵巢組織片體外培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氧自由基，阻斷Bcl-2家族介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑線粒體通路，促進卵巢組織內(nèi)原始卵泡的體外存活和生長。這可能與卵巢組織中SOD活性增高、BCL-2表達活躍有關(guān)。在不同劑量組中，高劑量組的表現(xiàn)更顯著。