神經(jīng)生長因子對人原始卵泡體外發(fā)育影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，人們在探索原始卵泡的活化機(jī)制及降低卵泡體外培養(yǎng)過程中卵泡閉鎖率的過程中發(fā)現(xiàn)，它可能受卵巢組織來源的許多生長因子的調(diào)控。許多生理代謝的啟動過程都是受神經(jīng)信號調(diào)節(jié)的，依此類推，卵巢的神經(jīng)營養(yǎng)因子也可能是影響卵泡啟動發(fā)育的重要因子，Hirshfield等研究大鼠胚胎，發(fā)現(xiàn)靠近卵巢門的原始卵泡最先啟動生長發(fā)育，更支持了這一觀點(diǎn)，因?yàn)槁殉查T是胎鼠卵巢最先接受神經(jīng)支配的部位，神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長，原始卵泡在卵巢門暴露于神經(jīng)纖維釋放

2、的神經(jīng)遞質(zhì)中，神經(jīng)遞質(zhì)如血管活性腸肽(VIP，vasoactive intestinal peptides)通過腺苷酸環(huán)化酶配對受體，誘導(dǎo)cAMP形成，cAMP增加KL基因的表達(dá)從而促進(jìn)原始卵泡啟動，因而推論神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子(NGF，nerve growth factor)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，brain-derived neurotrophic factor)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(NT-4，neutrophin-4)

3、可能參與了啟動早期卵泡發(fā)育。 NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，1951年由Levi-montalcini在小鼠肉瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。NGF廣泛存在于動物體內(nèi)，是一種蛋白質(zhì)，含三種亞基α、β、γ，以α<,2> βγ<,2>五個亞基組成(分子量140000)，β亞單位是NGF分子的生物功能活性單位。 NGF通過TrKA受體促進(jìn)卵巢間質(zhì)細(xì)胞的增殖分化，Dissen等使用NGF基因缺失的小鼠模型發(fā)現(xiàn)新生小鼠卵巢間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，

4、使用抗PCNA (Droliferating cellular nuclear antigen，增殖細(xì)胞核抗原)及BrDU(bromodeoxyuridine，溴化脫氧尿嘧啶)檢測，發(fā)現(xiàn)NGF基因缺失小鼠的間質(zhì)細(xì)胞增殖率僅為對照組的一半；Lara等免疫中和了剛出生后小鼠體內(nèi)的NGF，發(fā)現(xiàn)卵巢中卵泡成腔受阻，小鼠初情期推遲，發(fā)情周期紊亂，說明NGF參與了體內(nèi)卵泡的發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)采用卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)的方法進(jìn)行原始卵泡的體外培養(yǎng)，為了促進(jìn)原始卵泡生

5、長，降低卵泡閉鎖率，在培養(yǎng)體系中添加神經(jīng)生長因子(NGF)、NGF中和抗體，研究NGF對人原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化、卵泡存活，卵泡雌孕激素分泌的作用。 材料與方法 1．組織來源 選取中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科、廣州市第二人民醫(yī)院2006年10月至11月進(jìn)行卵巢切除手術(shù)的女性患者21例作為研究對象，患者年齡31.71±5.20(21～38)歲，有規(guī)律月經(jīng)、無放化療史、半年內(nèi)無激素服用史且卵巢囊腫直徑<7cm，本實(shí)驗(yàn)得

6、到本院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)并獲患者知情同意。 2．實(shí)驗(yàn)方法 將在開腹或腹腔鏡下獲得的卵巢組織標(biāo)本立即放置在冰上保存的HEPES-MEM培養(yǎng)液中，30分鐘內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，在室溫下用HEPES-MEM培養(yǎng)液沖洗兩次后，移入裝有該液體的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下用外科手術(shù)刀片修剪卵巢標(biāo)本并切除卵巢髓質(zhì)，然后將卵巢皮質(zhì)切成2mm×2mm×1mm的皮質(zhì)片，將來自同一患者的皮質(zhì)片隨機(jī)分為5組：未培養(yǎng)組、NGF組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組、NGF抗

7、體組、同型抗體對照組。將5組于37℃、5﹪C02、95﹪空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天。培養(yǎng)結(jié)束后取卵巢組織作病理切片，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化(檢測PCNA，用陽性單位PU定量表達(dá)免疫組織化學(xué)的顯色反應(yīng)程度)、凋亡分析，RT-PCR檢測KLmRNA的表達(dá)變化，并檢測所換培養(yǎng)液雌孕激素水平。 結(jié)果 1、NGF對卵泡生長發(fā)育的影響培養(yǎng)結(jié)束后，NGF組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組及抗NGF組平均有33.83﹪±31.73﹪、53.51﹪±39.41

8、﹪、39.30±31.73﹪的卵泡處于原始階段，顯著低于未培養(yǎng)組原始卵泡所占比例82.16﹪±13.63﹪，P<0.01；NGF組原始卵泡比例低于基礎(chǔ)培養(yǎng)組，P<0.01；NGF組與抗.NGF組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。培養(yǎng)15天后，NGF組平均有54.14﹪±26.16﹪的卵泡是生長卵泡，明顯高于未培養(yǎng)組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組及抗NGF組的生長卵泡比例14.63﹪±15.00﹪、23.39﹪±28.66﹪、31.44±32.24﹪，P<0.01?；A(chǔ)培

9、養(yǎng)組與未培養(yǎng)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0.53；抗NGF組與基礎(chǔ)培養(yǎng)組，抗NGF組與未培養(yǎng)組均無差異，P分別為0.35，0.75。 未培養(yǎng)組中形態(tài)異常的卵泡占3.22﹪±7.48﹪，明顯低于基礎(chǔ)培養(yǎng)組、NGF組、抗NGF組的23.1﹪±30.94﹪、12.03﹪±11.75﹪、29.26±28.61﹪，P<0.05；NGF組異常卵泡比例低于抗NGF組異常卵泡，P<0.05；其余各組間異常卵泡比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 抗NGF組、

10、同型對照組培養(yǎng)15天后，平均有39.30﹪±31.73﹪、32.74﹪±29.33﹪的卵泡是原始卵泡，31.44﹪±32.24﹪及44.05﹪±40.45﹪的卵泡處在生長階段，有29.26﹪±28.61﹪、23.21﹪±27.20﹪的異常卵泡，兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。 2、NGF對卵泡及卵巢問質(zhì)細(xì)胞增殖的作用未培養(yǎng)組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組、NGF組、抗NGF組、同型抗體對照組卵巢組織中PCNA陽性卵泡比例分別為28.45﹪(3

11、3/116)、37.25﹪(19/51)、59.79﹪(58/97)、22.72﹪(5/22)、33.33﹪(10/30)，NGF組與未培養(yǎng)組及抗NGF組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均0.005；未培養(yǎng)組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組、NGF組、抗NGF組之間卵巢間質(zhì)細(xì)胞PCNA的PU值分別為6.63±3.77、5.66±4.74、12.48±6.61、6.67±4.58， NGF組PU值顯著高于未培養(yǎng)組、基礎(chǔ)

12、培養(yǎng)組、抗NGF組，P<0.05，其余各組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。 3、NGF對卵泡及卵巢間質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用TUNEL實(shí)驗(yàn)后，各組未發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞凋亡；未培養(yǎng)組未見間質(zhì)細(xì)胞凋亡；NGF組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組、抗NGF組間質(zhì)細(xì)胞凋亡指數(shù)分別是0.06±0.06、0.12±0.07和0.14±0.09，NGF組凋亡指數(shù)明顯低于基礎(chǔ)培養(yǎng)組、抗NGF組，P<0.01；基礎(chǔ)培養(yǎng)組與抗NGF組間沒有差異，P=0.49?？筃GF組與同型對照組(

13、凋亡指數(shù)0.12±0.09)之間相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.41。 4、NGF對KLmRNA表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)將10例患者基礎(chǔ)培養(yǎng)組與NGF組培養(yǎng)后卵巢組織進(jìn)行RT-PCR半定量法檢測KLmRNA的表達(dá)情況。NGF組的KLmRNA表達(dá)0.91±0.30略高于基礎(chǔ)培養(yǎng)組的0.83±0.32，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。 5、NGF對雌激素、孕激素水平的影響培養(yǎng)結(jié)束后，本實(shí)驗(yàn)測量了12例患者雌激素、孕激素，每份標(biāo)本