晚期糖基化終末產(chǎn)物對體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡休眠-激活影響的研究.pdf

1、目的:卵巢微環(huán)境自由基增齡性累積造成的應(yīng)激損傷是導(dǎo)致卵巢過早衰老的重要原因。由晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)及其受體(RAGE)組成的AGEs-RAGE軸是介導(dǎo)氧化應(yīng)激的重要媒介?，F(xiàn)有研究顯示，卵巢中存在AGEs的沉積及其受體RAGE的表達(dá)，且呈顯著增齡性上升。而AGEs在卵巢中沉積的時(shí)間(28.8歲)稍早于卵巢功能開始下降的時(shí)間（30歲）。因此，我們推測AGEs-RAGE軸可能是啟動(dòng)或加速卵巢衰老發(fā)生的重要通路，AGEs可能會(huì)影響原始

2、卵泡的激活。本研究利用卵巢體外培養(yǎng)體系，通過添加不同濃度的AGEs(AGE-BSA)，運(yùn)用HE染色、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色探究AGEs對體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡休眠/激活的影響，進(jìn)一步了解AGEs與卵巢衰老的關(guān)系。
　　方法:獲取新生4天ICR小鼠卵巢，隨機(jī)分為五組:基礎(chǔ)培養(yǎng)組、200μg/ml BSA組、50μg/ml AGE-BSA組、100μg/ml AGE-BSA組和200μg/ml AGE

3、-BSA組?；A(chǔ)培養(yǎng)組的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM/F12+0.1％ BSA+0.1％Albumax+0.05mg/ml L-ascorbic acid+1％ ITS+250U/ml Penicillin-streptomycin)。200μg/ml BSA組、50μg/ml AGE-BSA組、100μg/ml AGE-BSA組和200μg/mlAGE-BSA組的培養(yǎng)基分別為在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加200μg/ml BSA、50μg/mlA

4、GE-BSA、100μg/ml AGE-BSA和200μg/ml AGE-BSA的培養(yǎng)基。將上述五組卵巢置于37℃、6％ CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，隔天半量換培養(yǎng)液一次。收集培養(yǎng)第2天換下的培養(yǎng)液和第4天培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液，用化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)液中E2的濃度。固定培養(yǎng)結(jié)束后的卵巢，制作卵巢組織切片，行HE染色、PCNA免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色。選取每個(gè)卵巢最大切面計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡、PCNA陽性卵泡和凋亡卵泡數(shù)量，比較各

5、組間生長卵泡率、PCNA陽性卵泡率、凋亡卵泡率和培養(yǎng)液中E2濃度的差異。
　　結(jié)果:(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)組生長卵泡率（13.4％±4.4％）略低于200μg/ml BSA組(15.4％±2.2％)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);50μg/ml AGE-BSA組生長卵泡率（16.3％±4.8％）略高于200μg/ml BSA組（15.4％±2.2％），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;100μg/ml AGE-BSA組生長卵泡率（19.3

6、％±1.8％）高于200μg/ml BSA組（15.4％±2.2％），但差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);200μg/ml AGE-BSA組生長卵泡率（22.6％±7.5％）顯著高于200μg/ml BSA組（15.4％±2.2％），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。200μg/ml AGE-BSA能促進(jìn)4日齡ICR小鼠卵巢的原始卵泡在卵巢體外培養(yǎng)過程中向生長卵泡轉(zhuǎn)化。(2)各組PCNA陽性卵泡率分別為:基礎(chǔ)培養(yǎng)組（65.0％±5.1

7、％），200μg/ml BSA組（60.5％±8.3％），50μg/ml AGE-BSA組（98.6％±2.1％），100μg/ml AGE-BSA組（99.1％±1.7％），200μg/ml AGE-BSA組（99.2％±1.1％）;基礎(chǔ)培養(yǎng)組略高于200μg/ml BSA組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）;50μg/ml AGE-BSA組、100μg/ml AGE-BSA組和200μg/ml AGE-BSA組均顯著高于200μg/

8、ml BSA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。50μg/ml AGE-BSA組、100μg/mlAGE-BSA組和200μg/ml AGE-BSA組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。AGE-BSA增加4日齡ICR小鼠卵巢在體外培養(yǎng)過程中PCNA的表達(dá)。(3)基礎(chǔ)培養(yǎng)組、200μg/mlBSA組、50μg/ml AGE-BSA組、100μg/ml AGE-BSA組和200μg/ml AGE-BSA組凋亡卵泡率分別為:9.2％±3.6％、

9、9.4％±9.3％、3.7％±2.4％、2.4％±1.5％和3.8％±1.8％，五組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.138)。AGE-BSA未增加4日齡ICR小鼠卵巢體外培養(yǎng)過程中卵泡的凋亡。(4)各組培養(yǎng)第2天收集的培養(yǎng)液中E2濃度(pg/ml)分別為:基礎(chǔ)培養(yǎng)組(168.9±13.1)，200μg/ml BSA組(167.4±11.3)，200μg/ml AGE-BSA組(166.1±11.6)，三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各組

10、培養(yǎng)第4天收集的培養(yǎng)液中E2濃度(pg/ml)分別為:基礎(chǔ)培養(yǎng)組(169.6±19.1)，200μg/mlBSA組(168.1±7.2)，200μg/ml AGE-BSA組(160.0±6.2)，三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?；A(chǔ)培養(yǎng)組、200μg/ml BSA組和200μg/ml AGE-BSA組內(nèi)培養(yǎng)第2天和培養(yǎng)第4天收集的培養(yǎng)液中E2濃度亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。AGE-BSA未影響4日齡ICR小鼠卵巢體外培養(yǎng)過程