骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4對人原始卵泡體外存活和生長發(fā)育影響的實驗研究.pdf

1、女性卵巢皮質(zhì)內(nèi)的大量原始卵泡構(gòu)成維持其一生生殖活動的卵泡庫，但在生理情況下女性從青春期卵巢初步具備生殖能力到圍絕經(jīng)期卵巢功能趨向衰竭，卵泡庫中僅約1％的卵泡能夠成熟并排出卵子，絕大多數(shù)卵泡在不同的發(fā)育階段退化閉鎖。而隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步，癌癥患者經(jīng)抗癌治療后生存率顯著提高，但女性患者經(jīng)過抗癌治療后將面臨卵巢功能衰竭的危險。與此同時，現(xiàn)代社會越來越多的女性由于職業(yè)競爭壓力增大而不得不一再推遲生育，使得在最佳生育年齡排出的卵子無法利用，等到希

2、望生育時，由于卵巢內(nèi)多數(shù)卵子已排出造成卵巢生殖能力下降，以及年齡增長對卵子質(zhì)量的負(fù)面影響等原因而引起不孕不育，而且也給優(yōu)生優(yōu)育帶來隱患。如果能將女性的生殖資源保存起來，充分利用卵泡庫，不僅能為接受抗癌治療的女性提供生殖保險，減少由于生育問題引起的家庭和社會矛盾，而且能解除職業(yè)女性的后顧之憂，解決其不孕不育以及優(yōu)生優(yōu)育問題，必將帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，于是卵巢生殖能力的保存成為近年來生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。 相對于藥物保護卵

3、巢、卵巢手術(shù)移位、胚胎冷凍保存、卵子冷凍保存和卵子贈送等保存女性生殖能力的方法，卵泡體外培養(yǎng)尤其是聯(lián)合卵巢組織冷凍保存以及卵巢組織移植，由于具有卵巢組織取材不依賴于月經(jīng)周期、不需要超排卵刺激卵巢、不耽誤患者的疾病治療等優(yōu)點，被認(rèn)為是一種較有前途的保存卵巢功能的方法。 哺乳動物原始卵泡體外生長和成熟的能力在1996年由Eppig和O'Brien首先證實，他們將小鼠的原始卵泡在體外培養(yǎng)成熟，并經(jīng)體外受精和胚胎移植后獲得成活小鼠，這為

4、利用原始卵泡進行體外生長(invitrogrowth，IVG)、體外成熟(invitromaturation，IVM)和體外受精(invitrofertilization，IVF)獲得成活后代以保存女性生殖功能提供了可能。雖然近年來許多生殖中心在IVM方面取得了可喜的成績，但人類原始卵泡的體外培養(yǎng)技術(shù)還沒有取得突破，原始卵泡的啟動機制還不明確，需要我們進行更多的探索。 在卵泡生長發(fā)育過程中原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化和初級卵泡向次級卵

5、泡轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是卵泡生長過程中的限速步驟。目前我們對有關(guān)原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化的機制了解甚少，有實驗顯示分離后卵泡或卵巢皮質(zhì)在體外培養(yǎng)時原始卵泡可以在無性激素的條件下轉(zhuǎn)化為初級卵泡，動物實驗也證實在切除垂體的大鼠中同樣可以觀察到原始卵泡向初級卵泡的過渡，推測這一過程是不依賴性激素的，啟動原始卵泡生長的確切物質(zhì)和機制仍有待于進一步闡明。 卵泡閉鎖是卵母細胞通過一定機制而湮沒的過程，是卵泡生長過程中的必要環(huán)節(jié)之一，卵泡閉鎖的出現(xiàn)調(diào)整了

6、生殖細胞的儲備量，導(dǎo)致了兩次生殖細胞儲備量的下調(diào)。卵泡閉鎖的本質(zhì)可能是細胞凋亡，幾種促存活和促凋亡分子參與了卵泡凋亡的發(fā)生，兩類分子復(fù)雜的平衡調(diào)節(jié)決定了卵泡的最終命運，對這些分子的進一步研究將有利于降低卵泡體外培養(yǎng)過程中的卵泡丟失，有助于對卵巢組織中卵泡資源的充分利用和女性生殖能力的保存。 近年來，人們在探索原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化機制及降低卵泡體外培養(yǎng)過程中卵泡閉鎖率時，逐漸將目光轉(zhuǎn)向生長因子，尤其是卵巢自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組成成員，

7、已有證據(jù)表明卵巢組織來源的轉(zhuǎn)移生長因子超家族中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMPs)家族參與了這一過程。 BMPs是轉(zhuǎn)移生長因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族中最大的一個家族，至今已有約15種BMP被報道。其中BMP-4的最初命名是由于其在骨和軟骨代謝中的作用，后來的研究顯示BMP-4參與胚胎中胚層形成的調(diào)節(jié)、原始生殖細胞的形成、肢芽調(diào)節(jié)和發(fā)

8、育過程中多種器官系統(tǒng)的形成，其在哺乳動物卵巢中的功能由Shimasaki等在1999年報道。目前認(rèn)為BMP-4在小鼠卵巢中的表達部位是卵泡膜細胞，而其受體是在顆粒細胞和卵母細胞中表達。實驗發(fā)現(xiàn)，BMP-4可以促進小鼠顆粒細胞FSH誘發(fā)的雌二醇分泌，同時降低孕激素的分泌，被稱為“黃體化抑制劑”，來自羊的實驗還發(fā)現(xiàn)，BMP-4不僅可以抑制FSH刺激的孕激素分泌，還可以抑制孕激素的基礎(chǔ)分泌。在新生小鼠卵巢的體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，外源性BMP-4

9、可以促進原始卵泡向初級卵泡的轉(zhuǎn)化，而加入BMP-4特異性中和抗體后卵巢體積明顯縮小，卵泡數(shù)量明顯減少，凋亡陽性細胞明顯增加，卵巢組織形態(tài)喪失，說明BMP-4在卵泡生長發(fā)育和存活方面可能發(fā)揮重要作用。 本實驗通過在卵巢組織體外培養(yǎng)過程中加入重組人BMP-4，了解其在人類原始卵泡向生長卵泡轉(zhuǎn)化方面的作用，分析其對卵泡基礎(chǔ)雌孕激素分泌的影響，觀察對培養(yǎng)過程中卵泡、卵巢間質(zhì)細胞存活的影響，為進一步研究卵泡生長轉(zhuǎn)化機制和卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)的

10、后期臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 材料與方法 1.組織來源 選取中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科2005年5月至11月進行卵巢切除手術(shù)的女性患者34例作為研究對象，患者年齡29.96±5.14歲(14～38歲)，有規(guī)律月經(jīng)、無內(nèi)分泌紊亂、無放化療史、半年內(nèi)無激素服用史且卵巢囊腫直徑＜7cm，該實驗得到本院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)并與患者簽署知情同意書。 2.實驗方法 2.1組織培養(yǎng)： 將在開

11、腹或腹腔鏡下獲得的卵巢組織標(biāo)本立即放置在室溫保存的HEPES-MEM培養(yǎng)液中，30分鐘內(nèi)送至實驗室，在室溫下用HEPES-MEM培養(yǎng)液沖洗兩次后，移入裝有該液體的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下用外科刀片修剪卵巢標(biāo)本并切除卵巢髓質(zhì)，然后將卵巢皮質(zhì)切成2mm×2mm×1mm的皮質(zhì)片，將來自同一患者的皮質(zhì)片隨機分為研究組(即BMP-4組)、對照組和未培養(yǎng)組，研究組和對照組于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，每隔兩天更換400μl培養(yǎng)液，更換過的

12、培養(yǎng)液收集到EP管中于-20℃保存，培養(yǎng)結(jié)束后進行雌孕激素測定。 2.2組織學(xué)檢查和凋亡分析： 未培養(yǎng)組、體外培養(yǎng)15天后的對照組和研究組卵巢組織用10％福爾馬林固定后行組織學(xué)檢查，切片厚度5μm，HE染色后閱片，每個標(biāo)本觀察10個高倍鏡視野，計數(shù)其中原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡，計算三組原始卵泡和生長卵泡(包括初級和次級卵泡)所占百分比；同時選取對照組和研究組具有卵泡的切片行細胞凋亡檢測(TUNEL)，細胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯

13、的彌散性或顆粒性深藍色染色定為凋亡陽性細胞，卵母細胞內(nèi)或/和≥50％顆粒細胞出現(xiàn)陽性TUNEL染色計為凋亡卵泡，10個高倍視野下(×400)計數(shù)卵泡和間質(zhì)細胞凋亡陽性細胞數(shù)，分別計為卵泡凋亡指數(shù)(apoptoticindexoffollicle，AIF)和間質(zhì)細胞凋亡指數(shù)(apoptoticindexofstromacell，AIS)。 2.3雌孕激素測定： 所有組織培養(yǎng)結(jié)束后，將貯存的裝有更換過培養(yǎng)液的EP管于室溫下解

14、凍，并將每一標(biāo)本的培養(yǎng)液集中于測定管中，用ACS：180自動化學(xué)免疫發(fā)光儀進行培養(yǎng)液中雌孕激素測定。 結(jié)果 1.BMP-4對卵泡生長發(fā)育的影響 未培養(yǎng)組、對照組和研究組平均10個高倍鏡視野下觀察到的卵泡個數(shù)分別為4.14±3.56、3.14±3.04、3.38±2.36，三組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。培養(yǎng)結(jié)束后對照組和研究組平均有57.59％±34.63％和47.87％±39.99％的卵泡處于原始卵泡階段，顯著低于未培養(yǎng)

15、組的原始卵泡所占比例90.97％±9.12％，P＜0.01，而對照組和研究組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。 培養(yǎng)15天后，在研究組和對照組平均有52.13％±39.99％和42.41％±34.63％的卵泡是生長卵泡，兩組之間差異無顯著性，但明顯高于未培養(yǎng)組的生長卵泡所占比例9.03％±9.11％，P＜0.01。 2.BMP-4對基礎(chǔ)雌孕激素分泌的影響 培養(yǎng)15天后，對照組和研究組培養(yǎng)液中雌二醇的含量分別是1347.83±73

16、8.36ng/ml和946.67±476.02ng/ml，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；孕激素的含量分別是5.91±3.54μg/l和3.57±2.04μg/l，研究組孕激素濃度明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。 3.BMP-4對卵泡和間質(zhì)細胞存活的影響 TUNEL切片中，對照組和研究組分別計數(shù)68和89個卵泡，未發(fā)現(xiàn)卵泡凋亡；兩組間質(zhì)細胞的凋亡指數(shù)分別是0.41±0.16和0.16±0.08，研究組間質(zhì)細胞凋亡指數(shù)