丹酚酸B聯(lián)合Ad-HGF修飾對(duì)MSCs存活和分化的影響.pdf

1、研究目的：
　　1.觀察丹酚酸B(SalB)和重組腺病毒Ad-HGF感染對(duì)MSCs的存活、增殖以及在缺氧環(huán)境下抗凋亡能力的影響;
　　2.探討SalB和重組腺病毒Ad-HGF感染誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的影響。
　　研究方法：
　　1.用貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠骨髓MSCs;
　　2.Ad-HGF感染MSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)最佳感染復(fù)數(shù)(MOI),RT-Q-PCR檢測(cè)感染后細(xì)胞中HGFmRNA的表達(dá);EL

2、ISA法檢測(cè)感染后細(xì)胞上清液HGF的水平;
　　3.AO/EB雙重?zé)晒馊旧珯z測(cè)細(xì)胞的存活,實(shí)驗(yàn)分4組:單純MSCs組、Ad-HGF組、SalB組和SalB+Ad-HGF組,各組作用細(xì)胞后第1天,進(jìn)行AO/EB染色,熒光顯微鏡下觀察;用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況;
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,實(shí)驗(yàn)分5組:常氧MSCs組、缺氧MSCs組、缺氧Ad-HGF組、缺氧SalB組、缺氧SalB+Ad-HGF組,AnnexinV/

3、PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá);
　　5.觀察SalB和Ad-HGF感染誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的情況,分組用5-Aza、Ad-HGF、SalB、5-Aza+SalB、5-Aza+Ad-HGF和SalB+Ad-HGF作用于MSCs,單純MSCs作為陰性對(duì)照組,5-Aza作為陽(yáng)性對(duì)照組,培養(yǎng)至3w倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞特異性蛋白

4、cTnT、Desmin、Connexin43的表達(dá);蛋白印跡法檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnT的表達(dá);熒光定量PCR檢測(cè)早期心肌細(xì)胞特異標(biāo)志物GATA-4和Nkx2.5的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.成功分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞接種24h后開(kāi)始貼壁,呈較大的橢圓形,48h后細(xì)胞貼壁逐漸增多,呈均勻一致的長(zhǎng)梭狀,并逐漸形成集落;
　　2.Ad-HGF按不同MOI感染后細(xì)胞生長(zhǎng)良好,MOI=200時(shí)細(xì)胞感染效率最高(

5、89.08％),可檢測(cè)出HGFmRNA的表達(dá),在細(xì)胞上清液檢測(cè)到HGF穩(wěn)定表達(dá),持續(xù)約21d;
　　3.AO/EB雙重?zé)晒馊旧@示Ad-HGF組和SalB組對(duì)MSCs的存活與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異;MTT示Ad-HGF組和SalB組對(duì)MSCs的增殖(OD值)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),兩者聯(lián)合效果更明顯(P<0.05);然而,5-Aza組OD值明顯較對(duì)照組小(P<0.05);
　　4.在缺氧環(huán)境下,Ad-HGF組

6、和SalB組與單純MSCs組相比可有效抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞的存活率(P<0.05);在蛋白水平上上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá),與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且兩者聯(lián)合作用效果更明顯(P<0.05);
　　5.誘導(dǎo)后,MSCs體積逐漸增大,形態(tài)變圓,2-3w時(shí)可見(jiàn)部分細(xì)胞胞體粗大,胞漿粗糙,在5-Aza+SalB組、5-Aza+Ad-HGF組和SalB+Ad-HGF組較5

7、-Aza組明顯,但單獨(dú)Ad-HGF組和SalB組形態(tài)改變不明顯;免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)顯示經(jīng)SalB作用和Ad-HGF感染誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnT、Desmin和Connexin43,蛋白印跡法示cTnT特異性條帶,熒光定量PCR見(jiàn)Nkx2.5和GATA-4陽(yáng)性表達(dá),在5-Aza+SalB組、5-Aza+Ad-HGF組和SalB+Ad-HGF組表達(dá)較5-Aza組強(qiáng),而SalB和Ad-HGF較5-Aza組弱,但較單純MSC