凍融人卵巢組織異種移植的卵泡保護(hù)和血管生成的初步研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代腫瘤治療方案的發(fā)展，腫瘤病人的生存率得以提高，也有越來越多非腫瘤疾病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病)的病人需要接受細(xì)胞毒性藥物治療。由于卵巢組織對化療、放療損傷的敏感性，這些治療都可能會造成卵巢功能損害。此外，某些因盆腔良性疾病需要行卵巢切除者，或有家族性卵巢早衰的婦女，都有可能面臨著卵巢早衰和生育力的喪失。因此，目前對于卵巢功能保護(hù)的需求已日益受到關(guān)注。 卵巢組織冷凍保存可用于保存女性生殖功能，卵巢組織凍存的主要

2、優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)本的收集不需要接受超排卵藥物的刺激，不延誤腫瘤的治療，而且，由于始基卵泡的結(jié)構(gòu)和代謝處于靜止?fàn)顟B(tài)，可以較好地耐受冷凍，因此卵巢組織凍存可以保存大量的始基卵泡。卵巢組織的冷凍方案和效果已經(jīng)較為穩(wěn)定，以卵巢組織片的慢速冷凍為主，卵泡存活率可達(dá)到70～90﹪。目前，凍融人卵巢組織自體移植的可行性己被兩個(gè)健康嬰兒的出生所證實(shí)。自體移植可以分為原位移植和異位移植，原位移植的好處是可以恢復(fù)正常的生殖功能和自然受孕，但是一些病人會存在輸卵管功

3、能缺陷或盆腔粘連，自然妊娠的機(jī)會下降。預(yù)期凍融后移植的卵巢組織片只有相對短的壽命，原位移植需要進(jìn)行腹腔鏡手術(shù)，反復(fù)的移植意味著多次腹腔鏡手術(shù)，這對病人是一種負(fù)擔(dān)，異位移植可能更合理。異位移植的部位包括皮下、肌肉內(nèi)、。腎囊下等。皮下移植操作比較簡便，重復(fù)性容易被接受，易于監(jiān)測卵泡發(fā)育和取卵，有一定的空間適合卵泡生長。皮下移植的可行性已經(jīng)有大量的研究報(bào)道，Lee DM等將猴卵巢組織自體移植在皮下，通過體外受精，在代孕母猴生下了子代，Okta

4、y K等報(bào)道移植凍融后人卵巢組織到腹部皮下，從移植物中獲取卵子進(jìn)行體外受精，獲得了一個(gè)4細(xì)胞胚胎，M．Rosendahl等報(bào)道凍融人卵巢組織的自體異位移植獲得了生化妊娠。影響卵巢組織移植成功率的主要原因之一是移植后缺血再灌注損傷導(dǎo)致大量卵泡丟失。多個(gè)研究表明移植后卵巢中卵泡的丟失主要是由于在移植早期缺血缺氧及再灌注損傷所致，而非直接的冷凍損傷，移植后卵巢組織中始基卵泡的丟失可達(dá)50～65﹪。因此，有必要找到有效的方法來促進(jìn)血管生成和減輕

5、缺血缺氧、再灌注損傷。Wang H等在小鼠的研究中認(rèn)為皮下移植前給予促性腺激素處理可以改善卵泡的存活，可能是由于促進(jìn)了VEGF基因表達(dá)，改善血管生成。但Schnorr J等發(fā)現(xiàn)局部給予VEGF并不能改善移植物中始基卵泡的存活，可能是因?yàn)橥庠葱訴EGF在體內(nèi)代謝較快的原因。也有學(xué)者研究在缺血階段通過應(yīng)用抗氧化劑減輕損傷。D．Nugent等認(rèn)為使用維生素E可以減輕移植在小鼠腎囊下的卵巢皮質(zhì)塊的缺血再灌注損傷，卵泡存活率從45﹪提高到72﹪；

6、但weissman等卻并沒有發(fā)現(xiàn)維生素E能提高卵泡存活率。Kim等報(bào)道卵巢組織片在體外缺血時(shí)期添加維生素C可以減少缺血損傷，減少卵泡和基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。 還原型谷胱甘肽(Redtreed Glutathione，GSH)，是機(jī)體內(nèi)的一種強(qiáng)抗氧化劑，含有較多的巰基，可與體內(nèi)自由基結(jié)合，直接使自由基還原，加速自由基清除，參與細(xì)胞的防御機(jī)制，包括細(xì)胞解毒及細(xì)胞的損傷與修復(fù)等，可以作為谷胱甘肽過氧化物酶的底物，抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞膜完

7、整性，維持細(xì)胞的正常代謝和功能。臨床研究觀察證明，GSH作為抗氧化劑和細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)劑，在多學(xué)科、多病種特別是重癥病人救治中是重要的治療和輔助治療藥物。烏司他丁(Ulinastat-in，UTI)是一種高效廣譜的酶抑制劑，對胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶和透明質(zhì)酸酶等有抑制作用。近年來研究顯示，UTI不但能夠抑制多種酶的活性，另具有穩(wěn)定溶酶體膜以及清除氧自由基，抑制多種炎癥介質(zhì)的過度釋放，阻斷應(yīng)激時(shí)炎癥因子與白細(xì)胞之間的聯(lián)系，改善微循環(huán)等

8、多種特殊的藥理作用，目前在胰腺炎、休克、器官移植等研究中，都顯示出了其有效性。 目前對卵巢組織異位移植后血管生成的研究主要是在動物卵巢組織移植方面，大致認(rèn)為最早在移植后48～72小時(shí)內(nèi)有新生血管形成，但目前尚未有報(bào)道對凍融人卵巢組織異位移植血管生成過程的研究。評價(jià)卵泡存活率傳統(tǒng)而可靠的方法是組織學(xué)切片閱片法，但需要專業(yè)的技術(shù)員和儀器，工作量大；用酶消化分離卵泡法評價(jià)卵泡存活率更為方便，可直接把卵泡從卵巢組織中分離出來，結(jié)合活性染

9、色，從生物學(xué)上評價(jià)卵泡的存活情況，目前還未見報(bào)道探討該法用于評價(jià)移植后卵巢組織中卵泡存活率的有效性和可靠性。 綜上所述，GSH和UTI的抗氧化作用及對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已經(jīng)在多方面得到了驗(yàn)證，但目前尚未有GSH和UTI對凍融人卵巢組織移植的保護(hù)作用及凍融人卵巢組織異位移植血管生成過程的報(bào)道。本研究以雄性NOD—SCID小鼠作為動物模型，探討GSH和UTI對凍融人卵巢組織異位移植的卵泡保護(hù)作用，及在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察移植物的血管

10、生成情況；同時(shí)比較酶消化分離卵泡法用于評價(jià)移植后卵巢組織的卵泡存活率與傳統(tǒng)組織學(xué)切片評價(jià)法的一致性，探討有效的卵泡存活率評價(jià)方法和卵泡分離法。為人卵巢組織自體移植的臨床應(yīng)用及卵巢組織的卵泡分離、體外培養(yǎng)等進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 1．標(biāo)本來源 2005年11月至2006年4月期間在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院和中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行卵巢切除手術(shù)的子宮腫瘤患者6例，年齡31.8±5.7歲(24～38歲)，無化放療

11、史，按照病人年齡段分為3組：(1)24～27歲，(2)31～32歲，(3)38歲，每年齡段2例病人。 2．實(shí)驗(yàn)方法 在全麻下行開腹手術(shù)，手術(shù)剪活檢取得卵巢組織，去除肉眼可見卵泡、黃體及髓質(zhì)，將卵巢組織切成5X2mm、厚約1mm的組織塊，通過慢速冷凍法冷凍保存于液氮中。在移植當(dāng)天解凍，同一年齡段病人的卵巢組織片隨機(jī)分為4組：還原型谷胱甘肽組(GSH組)，烏司他丁組(UTI組)，還原型谷胱甘肽+烏司他丁組(GSH+UTI組)

12、，空白對照組。根據(jù)不同組別，在解凍液Ⅲ中加入不同藥物：GSH組添加濃度為5.O mM的GSH，UTI組添加100U/mL UTI，GSH+UTI組添加5.0 mMGSH和100U/mLUTI；對照組無添加GSH或UTI，在培養(yǎng)箱中平衡30min后，移植在雄性NOD-SCID小鼠背部皮下，從移植當(dāng)天起連續(xù)5天給接受移植的小鼠用藥：GSH組給予肌肉注射GSH2.0g/kg；UTI組給予尾靜脈注射UTI100，000U/kg；GSH-UTI組

13、同時(shí)給予GSH2.0g/kg和UTI100，000U/kg；對照組給予肌肉注射生理鹽水0.1ml，均為每天1次。分別在移植后第1天、3天、7天、14天、28天、56天和85天回收移植物，一半用于組織學(xué)檢查和免疫組化檢測，一半用于酶消化分離卵泡。 (1) 組織學(xué)檢查以4μm連續(xù)切片，HE染色，每隔16μm閱片，光鏡下計(jì)算形態(tài)正常的卵泡數(shù)及測量卵泡直徑，評價(jià)卵泡存活率和各階段卵泡的比例。 (2) 免疫組化采用具有種屬特異性的

14、CD34和CD31抗體對血管進(jìn)行標(biāo)記，計(jì)算微血管密度(MVD)，觀察移植物中人血管及新生的小鼠血管隨時(shí)間變化的趨勢，以及用VEGF抗體檢測VEGF蛋白在移植物中的表達(dá)，VEGF的表達(dá)用Histochemical Score(HS)進(jìn)行半定量評價(jià)。 (3) 酶消化分離卵泡法是將移植物剪碎至小塊后置入膠原酶I溶液中消化，在顯微鏡下回收卵泡，測量卵泡直徑并行活性熒光染色，計(jì)算卵泡存活率和各階段卵泡的比例。 結(jié)果 1．組

15、織學(xué)檢查結(jié)果解凍后卵巢組織的卵泡存活率為84.4±5.7﹪，-移植后各組的卵泡存活率較移植前明顯下降，移植后各時(shí)間點(diǎn)間的卵泡存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.018)，在移植后第1～3天達(dá)到低值(p=0.045)。各時(shí)間點(diǎn)平均卵泡存活率：GSH組為50.4±6.1﹪，UTI組為53.5±9.2﹪，GSH+UTI組為55.2±6.7﹪，均高于對照組(40.1±9.4﹪)(p=0.022)。 2．免疫組化檢測結(jié)果抗人CD34標(biāo)記的血管MV

16、D在移植后逐漸下降(p=0.024)，組別之間沒有顯著差別(p=0.81)。 3．酶消化分離卵泡結(jié)果各移植時(shí)間點(diǎn)之間卵泡存活率有明顯差異(p=0.0001)，在移植后第3～7天達(dá)到低值(p=0.0004)，各時(shí)間點(diǎn)平均卵泡存活率：GSH組為86.0±3.4﹪，UTI組為80.6±7.0﹪，GSH+UTI組為82±9.0﹪，與對照組(78,1±7,3﹪)比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.114)。 結(jié)論 1．本研究提示G

17、SH和UTI均可有效改善凍融人卵巢組織在雄性NOD-SCID小鼠皮下移植的卵泡存活率； 2．凍融人卵巢組織在沒有外源性促性腺激素刺激的作用下，可在雄性NOD-SCID小鼠皮下移植部位啟動卵泡生長，形成早期竇卵泡，提示皮下移植可使卵泡發(fā)育潛能得到保存； 3．凍融人卵巢組織在雄性NOD-SCID小鼠皮下移植后可快速地建立血供，VEGF的表達(dá)在移植早期明顯增加； 4．酶消化分離卵泡法可有效分離到存活率高的竇前卵泡，但用