K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌強(qiáng)毒力島HPI缺失株的構(gòu)建及相關(guān)毒力功能探析.pdf

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是導(dǎo)致新生仔豬腹瀉最常見的病原性大腸桿菌，能引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉，發(fā)病率高，死亡率也高。耶爾森菌強(qiáng)毒力島（High-pathogeniticity island，HPI）最早是在高致病性耶爾森菌中發(fā)現(xiàn)，與鐵載體的合成、攝取、運(yùn)輸有關(guān)，并且與耶爾森菌的毒力和致病性相關(guān)，對(duì)小鼠有強(qiáng)致死性。已有研究發(fā)現(xiàn)禽致病大腸桿菌(Avian pathoge

2、nic E coli，APEC)中也存在HPI，并且與細(xì)菌的毒力密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期在對(duì)K88 ac+ETEC國(guó)內(nèi)參考株C83902的全基因組測(cè)序中識(shí)別到一個(gè)約29kb的毒力島，與耶爾森菌HPI高度同源。為了探究HPI在K88ac+ETEC的功能作用，本研究針對(duì)K88ac+ETEC C83902中強(qiáng)毒力島HPI設(shè)計(jì)了如下試驗(yàn)。
　　1、利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建強(qiáng)毒力島HPI缺失株
　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)C

3、83902進(jìn)行全基因組測(cè)序的結(jié)果，設(shè)計(jì)針對(duì)強(qiáng)毒力島HPI缺失的引物，分別將能合成sgRNA的基因和HPI上下游同源臂融合到質(zhì)粒pTarget上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTargetT，該質(zhì)粒能穩(wěn)定表達(dá)sgRNA并提供同源重組的修復(fù)模板。將重組質(zhì)粒和含有編碼Cas9基因以及λ-RED重組酶系統(tǒng)基因的pCas質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入野生株C83902，進(jìn)行強(qiáng)毒力島HPI的無痕敲除;通過PCR驗(yàn)證，成功獲得了基因缺失株C83902△HPI。
　　2、強(qiáng)毒力島

4、HPI在K88ac+ETEC C83902中功能探析
　　在C83902△HPI構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，比較分析了野生株和缺失株的相關(guān)生物學(xué)特征的變化。體外生長(zhǎng)試驗(yàn)表明，在相同的培養(yǎng)條件下，野生株C83902和缺失株C83902△HPI在生長(zhǎng)周期的各個(gè)階段的生長(zhǎng)速度基本一致。在養(yǎng)分充足的條件下，缺失株的鐵載體合成量與野生株基本一致，沒有明顯變化。生物被膜定量試驗(yàn)表明缺失株的生物被膜形成能力明顯低于野生株，下調(diào)了50.97％(P＜0.05

5、)。細(xì)菌與仔豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2的粘附試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失株對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的粘附能力較野生株下降23.3％。研究進(jìn)一步通過Real-Time PCR試驗(yàn)檢測(cè)強(qiáng)毒力島HPI缺失株中重要毒力因子K88菌毛、sfm菌毛、絲氨酸蛋白酶、Ⅰ型菌毛、共生菌毛、莢膜、α菌毛、鼠傷寒沙門菌菌毛、長(zhǎng)極性菌毛、鞭毛、溶血素和彎曲菌毛等的主要亞單位編碼基因的轉(zhuǎn)錄量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，faeG的表達(dá)量下降了12.02％，sfmH的表達(dá)量下

6、降了15.58％，sepA的表達(dá)量下降了37％(P＜0.01)，fimH的表達(dá)量下降了11.78％，ecpA表達(dá)量下降了30.4％(P＜0.05)，kpsD的表達(dá)量下降了37.5％(P＜0.05)，clbD的表達(dá)量下降了37.75％(P＜0.05)，stfG的表達(dá)量下降了34.84％(P＜0.01)，ipfA的表達(dá)量下降了35.3％(P＜0.01)，fliC的表達(dá)量下降了41.2％(P＜0.01)，而hlyA和csgB的表達(dá)量幾乎沒有變