產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K-,88-ac-LT-,B-克隆與原核表達.pdf

1、為了研制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)基因工程疫苗，根據(jù)已發(fā)表的K<,88>ac和LT<,B>基因序列，分別設(shè)計并合成一對K<,88>ac引物和一對LT<,B>引物，利用PCR技術(shù)，從大腸桿菌C<,83902>中擴增出K<,88>ac基因和LTB基因，將擴增的DNA片段進行分離、純化、限制性內(nèi)切酶酶切、T<,4>DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒pQE30-K<,88>ac和pQE30-K<,88

2、>ac-LT<,B>，并轉(zhuǎn)化入XLl-Blue宿主菌，構(gòu)建含有K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>融合基因表達載體的重組菌株XL1-Blue(pQE30-K<,88>ac)和XLl-Blue(pQE30-K<,88>ac-LT<,B>)。經(jīng)酶切鑒定和DNA序列分析證實，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pQE30-K<,88>ac和pQE30-K<,88>ac-LT<,B>中含有K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>融合基因，且基因序

3、列和閱讀框架均正確。將重組菌株XLl-Blue(pQE30.K88ac)和XLl-Blue(pQE30-K<,88>ac-LT<,B>)分別按1％的量接種到含有Amp(60μtg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2h，然后用1mmol·L IPTG誘導(dǎo)6h，融合蛋白K<,88>ac和K<,88>aC-LT<,B>獲得高效表達。經(jīng)Western blot檢測，重組菌株表達的融合蛋白能夠被CT和K<,88>抗體識別。將表達的K<,8

4、8>ac和K<,88>ac-LT<,B>蛋白純化后免疫小鼠，再用C<,83902>大腸桿菌強毒菌株攻毒，K<,88>ac-LT<,B>蛋白具有更好的保護性。使用限制性內(nèi)切酶將K<,88>ac-LT<,B>基因片段從pQE30-K<,88>ac-LT<,B>載體上切下，連接在乳酸菌表達載體(pHCElLB-pgsA)上pgsA基因的3'端，構(gòu)建了pHCE1LB-pgsA-K<,88>ac-LT<,B>乳酸菌表達載體。 本研究成功構(gòu)