產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌Sta-K99融合基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是全球性人和動物傳染性腹瀉的重要病原體之一，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時給人類公共衛(wèi)生安全造成重要威脅。本研究利用PCR和基因重組等技術(shù)，克隆了產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌STa和K99基因，并將其融合構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒，將穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行包裝得到重組腺病毒。PCR鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組腺病毒載體Ad5 STaK99，在此基礎(chǔ)

2、上，利用Western blot方法對重組腺病毒進(jìn)行了融合蛋白表達(dá)的檢測及免疫原性研究，為研制預(yù)防由ETEC引起的新生動物腹瀉重組腺病毒載體疫苗奠定基礎(chǔ)。主要實驗結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)設(shè)計的特異引物，利用PCR技術(shù)，成功克隆了STa基因和K99基因，核苷酸序列測定結(jié)果有一個堿基突變，導(dǎo)致一個氨基酸的突變，分析表明，兩氨基酸性質(zhì)相同，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致，不影響蛋白的免疫原性。
　　 2.將克隆的STa、K99基因通

3、過T4連接酶與穿梭質(zhì)粒pAd5CMVK-NpA連接，成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pAd5 STa-K99。將穿梭質(zhì)粒pAd5 STa-K99和骨架質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ分別進(jìn)行酶切后回收，在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行包裝，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)，表明成功獲得了重組腺病毒。
　　 3.將獲得的重組腺病毒在293細(xì)胞內(nèi)大量擴增，通過CsCl密度梯度離心法進(jìn)行了純化，根據(jù)ST-K99融合基因特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶，表明STa-K99融合基因