大腸桿菌K1致病株外膜蛋白T毒力相關(guān)功能研究.pdf

1、大腸桿菌是存在于人和許多動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群,主要寄生在大腸內(nèi),屬于腸道正常菌群成員之一,某些血清型菌株的致病性強(qiáng),可引起腹瀉等腸道內(nèi)感染,另一類(lèi)大腸桿菌在一定條件下可引起腸道外感染,稱(chēng)之為腸外致病性大腸桿菌,可引起泌尿系統(tǒng)感染,敗血癥和腦膜炎等。
　　 本文為了研究ompT基因在大腸桿菌Kl株感染中的毒力機(jī)制,利用染色體同源重組構(gòu)建了大腸桿菌K1致病株E44的ompT基因敲除株,人BMEC單層細(xì)胞體外.BBB模型顯示,ompT

2、基因敲除導(dǎo)致大腸桿菌K1株體外黏附及侵襲BMEC能力降低,OmpT低表達(dá)水平質(zhì)?？梢曰净匮a(bǔ)突變株黏附能力至野生株水平；OmpT的表達(dá)可增強(qiáng)菌株的細(xì)胞毒效應(yīng)；血源擴(kuò)散乳鼠腦膜炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),ompT基因敲除后菌株突破BBB的能力大大降低；OmpT體外功能研究表明,兩步柱層析純化得到的大腸桿菌K1株外膜蛋白組分可以激活人血纖溶酶原并呈一定量效關(guān)系；利用超濾結(jié)合陽(yáng)離子交換層析制備了人尿來(lái)源抗菌肽,和野生株相比,ompT基因敲除株對(duì)尿陽(yáng)離子抗

3、菌肽的抵抗能力降低。
　　 一、大腸桿菌K1致病株ompT基因敲除及特性分析
　　 1、為了研究omp7基因在大腸桿菌致病中的毒力相關(guān)功能,構(gòu)建ompT基因敲除株OTD3。以E44基因組為模板,通過(guò)OMT-S1和OMT-B1引物PCR擴(kuò)增得到1.57 kb的片段FOT5,通過(guò)OMT-B2和OMT-X2引物PCR擴(kuò)增得到1.27 kb的片段FOT3,兩個(gè)DNA片段利用引物引入的BamH Ⅰ位點(diǎn)連接得到2.84 kb的omp

4、T基因中間缺失片段FOT53。利用Sal Ⅰ及Sac Ⅰ位點(diǎn)連入自殺載體pCVD442,構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pCVT53,pCVT53轉(zhuǎn)化入SM10λpir,與E44野生株接合轉(zhuǎn)移,PCR篩選得到突變株并命名為OTD3,并測(cè)序驗(yàn)證基因缺失。
　　 2、K1株E44的ompT基因全長(zhǎng)954 bp,編碼317個(gè)氨基酸,前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列,BLAST表明與大腸桿菌K12株OmpT(P09169316氨基酸)有96.2％氨基酸序列

5、同源性,兩者僅在肽鏈C端有部分氨基酸序列存在差異,C末端并不參與構(gòu)成酶活性中心及維持蛋白特定空間構(gòu)象。將帶有完整ORF的ompT基因序列插入質(zhì)粒pUC13得到重組質(zhì)粒pUCT。ompT基因處于lac_promoter的操控,用作回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)載體。
　　 3、與E44相比,OTD3表現(xiàn)出了微弱的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),E44及OTD3菌體的菌落形成能力并無(wú)顯著差異。ompT的敲除并未影響大腸桿菌重要黏附素Ⅰ型菌毛的表達(dá)。總體上ompT敲除對(duì)K1株基

6、本屬性無(wú)顯著影響,因而突變株適用于研究該基因?qū)Ω腥鞠嚓P(guān)毒力的影響。
　　 4、魚(yú)精蛋白是一類(lèi)天然的陽(yáng)離子抗菌肽,富含連續(xù)的Arg。我們考察了0、0.0l、0.1和1 mg/ml的魚(yú)精蛋白對(duì)E44生長(zhǎng)的影響,高濃度魚(yú)精蛋白直接殺滅菌體,低濃度范圍內(nèi)對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用,且呈一定量效關(guān)系。與野生株E44相比,OTD3對(duì)0.1 mg/ml的魚(yú)精蛋白敏感,引起生長(zhǎng)抑制。同樣的結(jié)果也在基因工程常用菌株BL21(DE3)、JM109及DH5

7、α中得到證實(shí),ompT+株對(duì)魚(yú)精蛋白的殺菌活性表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抵抗。魚(yú)精蛋白是OmpT的底物,對(duì)其敏感性間接反映了OmpT的表達(dá)水平及質(zhì)?；匮a(bǔ)效果,在隨后的侵襲相關(guān)研究中,利于對(duì)比OmpT的表達(dá)對(duì)侵襲各環(huán)節(jié)的影響。
　　 二、ompT基因敲除降低大腸桿菌K1株致病能力
　　 1、體外模型采用人BMEC單層細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前24 h,將BMEC鋪至24孔板,待細(xì)胞匯合成單層后備用(約105細(xì)胞/孔)。待測(cè)細(xì)菌37℃靜置培養(yǎng)24 h

8、至穩(wěn)定期,PBS適當(dāng)稀釋備用,以O(shè)D600估算菌濃,按感染倍數(shù),即細(xì)菌數(shù):細(xì)胞數(shù)約100:1接入待測(cè)菌,同時(shí)留樣涂平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)得確切菌濃。37℃孵育2 h后,PBS清洗4次后裂解細(xì)胞并涂布LB平板計(jì)菌落數(shù),此為黏附的細(xì)菌總數(shù),并計(jì)算黏附率。侵襲組三個(gè)復(fù)孔,與100μg/ml慶大霉素37℃孵育1 h來(lái)殺死所有胞外細(xì)菌,PBS清洗4次,裂解細(xì)胞涂布LB平板計(jì)菌落數(shù),即為胞內(nèi)菌數(shù),并計(jì)算侵襲率。與野生株E441、2和3 h的黏附率相比,OTD

9、3黏附BMEC單層細(xì)胞能力顯著降低。慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,侵襲能力上也表現(xiàn)出了相應(yīng)比例的降低,侵襲能力降低源于黏附能力的降低。OTD3轉(zhuǎn)化入低OmpT表達(dá)水平的回補(bǔ)質(zhì)粒pGEM-OmpT后,突變株黏附能力基本得到恢復(fù),而OmpT高表達(dá)質(zhì)粒pML19并不能回補(bǔ)突變株黏附能力。推測(cè)BMEC表面存在某種OmpT的底物,對(duì)其適度的水解利于菌體黏附過(guò)程。
　　 2、待測(cè)菌37℃靜置培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期,PBS適當(dāng)稀釋后,取約107細(xì)菌

10、接入?yún)R合的BMEC單層中,37℃孵育2,4和6 h,取上清并測(cè)定LDH活性,LDH釋放活性大小間接反映了細(xì)胞膜的受損程度。與ompT基因缺失株OTD3相比,野生株E44感染后4和6 h的細(xì)胞毒效應(yīng)更高。轉(zhuǎn)化了pML19的OTD3,過(guò)表達(dá)的OmpT介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)明顯高于攜帶空載體pUC19的野生株E44。與空白對(duì)照相比,ompT的非致病株BL21(DE3)與BMEC孵育也可以引起輕微的細(xì)胞毒效應(yīng),轉(zhuǎn)化了pML19后,BL21(DE3)/

11、pML19的細(xì)胞毒效應(yīng)大幅地提升。不同菌株的細(xì)胞毒效應(yīng)反映了一個(gè)趨勢(shì),OmpT的表達(dá)量與LDH的釋放即胞膜損傷正相關(guān),某種程度上證明了BMEC胞膜表面存在著OmpT的作用底物。
　　 3、五日齡的乳鼠被接種同劑量的E44及OTD3,感染18 h后,血樣及CSF樣本涂布LB平板計(jì)菌落數(shù)。接種ompT基因缺失株OTD3可以引起與野生株E44相似水平的菌血癥,23只接種了OTD3的乳鼠只有7只發(fā)生腦膜炎(30％),而17只接種了野生株

12、E44的乳鼠當(dāng)中,12只CSF培養(yǎng)呈陽(yáng)性,占了71％。omp7基因缺失顯著降低了大腸桿菌K1株穿越BBB的能力,與前面BMEC單層培養(yǎng)的體外BBB模型結(jié)果相符,綜合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果,ompT作為一種輔助毒力因子與菌體侵入BBB相關(guān)。
　　 三、大腸桿菌K1株OmpT體外功能
　　 1、裂解E44菌體,膜組分沉淀經(jīng)反復(fù)抽提粗純化后上樣至絲氨酸蛋白酶抑制劑親合層析柱Benzamidine Sepharose Fast Flow

13、,NaCl梯度洗脫,分段收集并電泳檢測(cè),按分子量判斷外膜蛋白集中在200 mmol/L NaCl洗脫,此步親和層析去掉絕大部分雜蛋白；再經(jīng)SOURCE 30Q強(qiáng)陰離子交換層析進(jìn)一步精純,收集約180 mmol/L NaCl洗脫組分,得到較純的外膜蛋白,主要由二個(gè)條帶組成,為分子量集中在37 kDa的包括OmpT在內(nèi)的大腸桿菌外膜組分,可用于隨后的體外活性研究。
　　 2、S-2251生色發(fā)光底物法測(cè)定外膜蛋白對(duì)人血纖維蛋白溶酶原

14、(plasminogen,Pig)的激活效應(yīng),激活產(chǎn)生的纖溶酶plasmin水解S-2251釋放對(duì)硝基苯胺(pNA),pNA在405 nm處有強(qiáng)吸收,pNA顯色的深淺與激活劑的活性成正比。由于商品化Plg中,殘存少量纖溶酶,所以對(duì)照組Plg的OD405也呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組加入高低兩個(gè)濃度的E44膜組分,Plg被激活,曲線斜率呈上升趨勢(shì),表明Plg不斷被激活,且與膜組分的加入量呈一定量效關(guān)系。而ompT敲除株OTD3制備的外膜組分不具有體

15、外激活Plg的效應(yīng)。利用相關(guān)毒力因子激活纖溶酶原是普遍存在的病原體突破宿主生理屏障、獲取養(yǎng)分及逃避宿主防御機(jī)制的策略。
　　 3、采用1 kDa截留分子量的Pellicon超濾膜對(duì)尿液中全蛋白進(jìn)行快速富集,隨后采用50 kDa截留分子量的超濾膜按分子量進(jìn)行分級(jí)分離,收集超穿組分即得MW<20 kDa的小分子尿蛋白,大分子量尿蛋白被截留。各步純化組分均用BL21(DE3)作為測(cè)定菌株,瓊脂糖擴(kuò)散法測(cè)定抗菌活性。結(jié)果表明只有小分子尿

16、蛋白組分表現(xiàn)出了明顯的抗菌活性。弱陽(yáng)離子交換CM Sepharose Fast Flow柱層析純化得到尿來(lái)源小分子陽(yáng)離子肽。TSK G2000SWx1凝膠過(guò)濾HPLC分析各步分離組分的分子量分布,50 kDa超穿組分分子量呈多峰分布,經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換層析后,得到了分子量分布呈單峰的洗脫組分,50 kDa超濾與陽(yáng)離子交換層析兩步即可制備分子量分布均一的尿來(lái)源陽(yáng)離子肽類(lèi),代表了正常尿液中存在的抗菌肽類(lèi),隨后考察了OmpT是否賦予了大腸桿菌對(duì)尿

17、抗菌肽的抵抗能力。
　　 4、ompT陽(yáng)性株表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗尿抗菌肽殺菌活性的能力。培養(yǎng)過(guò)程中加入尿陽(yáng)離子肽,K1株E44表現(xiàn)出了對(duì)抗菌肽更強(qiáng)的抵抗能力,生長(zhǎng)速率高于其ompT基因缺失株OTD3,ompT基因的敲除,降低了OTD3抵抗尿抗菌肽的能力。同時(shí)我們考察了基因工程常用菌株BL21(DE3)(ompT突變)和DH5α(ompT陽(yáng)性)的尿來(lái)源抗菌肽的敏感性。20 μg/ml的尿抗菌肽加入后,BL21(DE3)的生長(zhǎng)被完全抑制

18、,甚至被殺滅。pML19回補(bǔ)后,過(guò)表達(dá)的OmpT抑制了BL21(DE3)/pML19生長(zhǎng)的同時(shí),也增強(qiáng)了其對(duì)尿陽(yáng)離子肽的抵抗,但卻沒(méi)有達(dá)到DH5α對(duì)尿抗菌肽的抵抗能力。結(jié)果表明OmpT參與了尿來(lái)源陽(yáng)離子肽類(lèi)的水解失活。機(jī)體各組織細(xì)胞尤其是上皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等都維持一定水平的抗菌肽表達(dá),在炎癥及感染發(fā)生時(shí),抗菌肽表達(dá)水平會(huì)被迅速上調(diào)并持續(xù)高水平分泌,構(gòu)成固有免疫的防御系統(tǒng)重要組成部分。病原體會(huì)通過(guò)各種途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主抗菌肽殺菌活性的抵抗,來(lái)