動物源大腸桿菌耐藥基因與HPI毒力基因的檢測及相關(guān)性分析.pdf

1、大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種重要的能引起食源性疾病的人畜共患病原菌,隨著抗菌藥物的濫用,大腸桿菌耐藥性情況日益嚴(yán)重,而細(xì)菌的耐藥性可通過多種途徑進(jìn)行傳播,引起交叉耐藥,嚴(yán)重威脅著人類的健康。耶爾森菌強(qiáng)毒力島(highpathogenicityisland,HPI)通過奪取宿主中的鐵元素來增強(qiáng)細(xì)菌在宿主體內(nèi)存活的機(jī)率,進(jìn)而加重對機(jī)體患病的感染能力,毒力島的發(fā)現(xiàn)和研究,對深入了解細(xì)菌性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程以及對疾病的預(yù)防

2、控制都有著深遠(yuǎn)影響。
　　以大腸桿菌耐藥基因和HPI標(biāo)志性基因?yàn)檠芯繉ο?設(shè)計(jì)特異性引物,采用PCR技術(shù)對兩類基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增,通過反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化,建立大腸桿菌ESBLs耐藥基因(TEM、SHV)和HPI毒力基因(irp1、irp2、fyuA)的雙重PCR檢測方法,并對大腸桿菌中耐藥基因和HPI毒力基因之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、動物源大腸桿菌分離株耐藥表型的檢測
　　采用NC

3、CLS推薦的K-B法來檢測大腸桿菌分離株(豬源25株、雞源12株)對20種抗菌藥物的耐藥性,以大腸桿菌ATCC25922為藥敏質(zhì)控菌,記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　豬源大腸桿菌分離株對于常見的抗菌藥物阿莫西林(24/25,96％)、苯唑西林(23/25,92%)、氨芐西林(22/25,88%)、羧芐西林(21/25,84%)、阿莫西林/棒酸(21/25,84%)、氯霉素(23/25、92%)表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥性(≥80%)。
　　

4、雞源大腸桿菌分離株對于獸醫(yī)臨床中常見的抗菌藥物苯唑西林(12/12,100%)、氨芐西林(11/12,91.7%)、羧芐西林(11/12,91.7%)、阿莫西林(9/12,81.8%)、阿莫西林/棒酸(9/12,81.8%)表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥性(≥80%)。
　　其次豬雞源大腸桿菌對鏈霉素(18/25,72%、7/12,63.6%)、強(qiáng)力霉素(19/25,76%、6/11,54.5%)、復(fù)方新諾明(14/25,56%、7/11,63

5、.6%)、諾氟沙星(13/25,52%、7/11,63.6%)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性(50%~80%)。大腸桿菌分離株呈現(xiàn)出多重耐藥,其中對8~14種抗菌藥物具有多重耐藥性的菌株占總分離株73.0%(27/37)。該結(jié)果對于大腸桿菌分離株中的耐藥性做了一個初步的檢測分析,為后續(xù)基因型試驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　2、動物源大腸桿菌分離株耐藥基因和HPI毒力島基因的PCR檢測
　　以大腸桿菌耐藥基因與HPI毒力島基因作為研究切入點(diǎn),根據(jù)

6、GenBank中已發(fā)表的大腸桿菌標(biāo)志性基因序列,分別設(shè)計(jì)合成了大腸桿菌耐藥基因TEM、SHV、OXA、cmlA、floR、sul-I、sul-II、tetA、tetB、aac(3)-II、aph(3’)-II和毒力島irp1、irp2、fyuA等14對特異性引物,提取大腸桿菌DNA作為模板,對大腸桿菌耐藥基因和HPI毒力島基因進(jìn)行PCR檢測,并對PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,大腸桿菌耐藥基因和HPI毒力島基因引物TEM、SHV、

7、OXA、cmlA、floR、sul-I、sul-II、tetA、tetB、aac(3)-II、aph(3’)-II、irp1、irp2和fyuA能擴(kuò)增出目的片段,大小分別是118、132、190、467、601、925、179、344、388、412、232、799、414、948bp。
　　通過優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系對所有大腸桿菌分離株的耐藥基因和HPI毒力基因進(jìn)行了檢測,為建立雙重PCR同時檢測以上兩類基因提供數(shù)據(jù)和

8、理論基礎(chǔ)。
　　3、動物源大腸桿菌ESBLS耐藥基因和HPI毒力基因雙重PCR檢測及相關(guān)性分析
　　在單重PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上,對雙重PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系中的引物濃度和Tm值進(jìn)行優(yōu)化。檢測結(jié)果顯示,檢出irp1+TEM、irp1+SHV、irp2+TEM、irp2+SHV、fyuA+TEM、fyuA+SHV基因的陽性率分別為13.5%、13.5%、21.6%、21.6%、16.2%、16.2%。在大腸桿菌

9、中擴(kuò)增出118、132、799、414、948bp的特異性目的條帶,而甲型副傷寒沙門氏菌、綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌中則不能擴(kuò)增出。靈敏度試驗(yàn)表明,該反應(yīng)體系的檢測靈敏度為1.5×103CFU/mL。irp2缺失株試驗(yàn)表明,irp2中仍能檢測出TEM、SHV、sulII、aac(3)-II、cmlA、floR基因。大腸桿菌中ESBLs耐藥基因和HPI基因通過雙重PCR方法均能特異檢測出,缺失株試驗(yàn)證實(shí)兩類基因間無明顯相關(guān)性。