大腸桿菌ETT2毒力島的檢測與分析.pdf

1、由大腸桿菌引起的疾病仍是一個沒有完全解決的問題,給養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失不可低估;新近發(fā)現(xiàn)的各種毒力島(PAI)使得大腸桿菌的致病力更具復(fù)雜性。ETT2(E.coli type three secretion system2)毒力島全稱為大腸桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)2,約29.9 kb。國外已有關(guān)于ETT2的報道。
　　 本研究選擇江蘇地區(qū)不同豬場的斷奶仔豬水腫病和腹瀉病料以及江蘇5個奶牛場的奶牛乳腺炎病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),根據(jù)對已所發(fā)表的E

2、TT2毒力島ECs3703和ECs3737基因序列的分析,設(shè)計2對特異性核苷酸引物并建立PCR檢測方法。通過對臨床病料的快速檢測,表明32.50％的仔豬腹瀉病例存在ETT2+大腸桿菌感染,而仔豬水腫病例和仔豬腹瀉并發(fā)水腫病例的感染率分別為92.11％和91.67％;ETT2+大腸桿菌感染同樣也見于奶牛乳腺炎病例,其感染率為38.98％。
　　 為了揭示ETT2毒力島和大腸桿菌其他毒力因子的相關(guān)性,對22株ETEC、46株STEC

3、、24株STEC/ETEC進(jìn)行了ETT2毒力島的PCR鑒定,結(jié)果顯示ETT2毒力島在ETEC和STEC中都被檢測到。另外,數(shù)據(jù)還顯示,在STEC和STEC/ETEC中ETT2的攜帶率要高于ETEC。其中ETT2陽性分離株占ETEC菌株的77.27％(17/22),然而ETT2陽性分離株分別占STEC和STEC/ETEC菌株的86.96％(40/46)和83.33％(20/24)。通過對123株奶牛乳腺炎源大腸桿菌的分析,ETT2攜帶率為

4、37.40％(46/123);在這46株ETT2陽性分離株中,STb、Lta、HPI、CNF2、F17a、Tra和Hly的基因檢出率分別為67.39％(31/46)、39.13％(18/46)、36.96％(17/46)、52.17％(24/46)、4-35％(2/46)、45.65％(21/46)、19.57％(9/46)。
　　 根據(jù)GenBank中所發(fā)表的ETT2毒力島的35個基因序列,設(shè)計35對特異性核苷酸引物。通過對參

5、考菌株的PCR擴(kuò)增以及PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析,證明了所設(shè)計的引物可用于ETT2毒力島35段基因的特異性PCR檢測。用建立的此PCR檢測方法對123株ETT2+大腸桿菌(其中ETEC24株、STEC40株、STEC/ETEC22株,奶牛乳腺炎源46株)的ETT2毒力島基因進(jìn)行鑒定,結(jié)果共檢測到11種ETT2毒力島的類型,包括1個完整型(命名為A型)和10個不同程度的缺失型(分別命名為B、C、D、E、F、G、H、I、J和K型)。其中,豬

6、源ETT2陽性分離株的ETT2類型有5種(A、B、E、F和G),其中來自ETEC的17株ETT2陽性大腸桿菌中,3(17.65％)株屬于ETT2完整型(A型),1(5.88％)株屬于B型,9(52.94％)株屬于E型,2(11.76％)株屬于F型和2(11.76％)株屬于G型;來自STEC/ETEC的20株ETT2陽性大腸桿菌中,3(15.00％)屬于A型,9(45.00％)屬于B型和8(40.00％)屬于E型;然而來自STEC的40株

7、ETT2陽性大腸桿菌中,僅發(fā)現(xiàn)了兩種類型,其中33(82.50％)株屬于A型,7(17.50％)株屬于E型。進(jìn)一步分析顯示,A型與Stx2e具有高度的相關(guān)性。然而,在奶牛乳腺炎病例中所獲得的ETT2類型有8種(B、C、D、E、H、I、J和K型),但是有6種(C、D、H、I、J和K型)是在豬源大腸桿菌中沒有發(fā)現(xiàn)的。然而在奶牛乳腺炎病例的ETT2陽性分離株中沒有檢測到ETT2的A型、F型和G型。
　　 為確定ETT2毒力島對大腸桿菌

8、毒力的貢獻(xiàn),以評估其在動物中的致病危險,選擇在本研究中分離鑒定的6株(B型、D型、H型、I型、J型和K型各一株)具有ETT2毒力島不同程度缺失的分離株和1株(A型)具有完整的ETT2毒力島的大腸桿菌為材料,以消化道為感染途徑,測定其對4周齡的健康ICR小鼠的半數(shù)致死量(LD50),以確定所分離的菌株致病力的大小。結(jié)果顯示,B型菌株的LD50為5.335×105(0.2 mL),A型、H型、J型菌株的LD50均為9.486×107(0.2