大腸桿菌毒力島HPI相關(guān)基因缺失株的研究.pdf

1、耶爾森菌強(qiáng)毒力島(highpathogenicityisland，HPI)是最早發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌中的，大小從36kb到43kb，能夠編碼攝取鐵載體耶爾森菌素(yersiniabactin，Ybt)的基因及其調(diào)節(jié)基因(irp1、irp2、fyuA)，與鐵攝取與調(diào)節(jié)有關(guān)，是表達(dá)小鼠致死表型不可缺少的遺傳單元;是決定該菌致病性和毒力的重要因素之一。我們已發(fā)現(xiàn)HPI存在于多種腸道桿菌中，如大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯菌等，HPI可能是通過基因的水平

2、轉(zhuǎn)移在不同種屬中分布。HPI不僅賦予病原體這樣特殊的致病力，與感染過程有關(guān)，而且在細(xì)菌進(jìn)化過程中同樣扮演重要角色。為揭示HPI毒力島對大腸桿菌毒力的影響，本文做了三個(gè)方面的研究:
　　 一是利用Red重組系統(tǒng)對2株HPI+菌的這四個(gè)基因的單基因缺失株分別進(jìn)行基因敲回，篩選出敲回成功的菌株。irp1、irp2、fyuA、ybtA是HPI毒力島的四個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，與毒力島的毒性有著密切的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)先合成出含有重組同源臂的這四個(gè)基因

3、的部分PCR產(chǎn)物，利用Red重組原理30℃表達(dá)出誘導(dǎo)蛋白，將該P(yáng)CR產(chǎn)物分別與單基因缺失株重組，從而實(shí)現(xiàn)基因的互換。篩選出重組成功的菌株，由于重組成功的細(xì)菌沒有任何篩選標(biāo)記，而未重組成功的細(xì)菌帶有FRT片段標(biāo)記的卡納抗性，所以本實(shí)驗(yàn)利用平板大量點(diǎn)樣的方法循序漸進(jìn)的篩選出重組成功的菌株。
　　 二是比較S793103菌株4個(gè)單基因缺失株（△irp1、△irp2、△ybtA、△fyuA）與原始毒株的在鐵缺陷型培養(yǎng)基NBD培養(yǎng)基中的生

4、長趨勢，來研究它的攝鐵性變化。為了進(jìn)一步研究豬源HPI+大腸桿菌毒力島相關(guān)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的鐵蛋白調(diào)節(jié)功能，采用鐵缺陷型培養(yǎng)基NBD培養(yǎng)原始野生毒株和基因缺失株，通過活菌計(jì)數(shù)從而來研究它們的生長特性，培養(yǎng)原始毒株與缺失株，采用NBD培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)監(jiān)測10小時(shí)達(dá)到細(xì)菌生長穩(wěn)定期，期間觀察測量它們的吸光值OD600，繪制出生長趨勢曲線圖，比較基因敲除前后它們的攝鐵功能變化情況。結(jié)果顯示其生長速度受到了一定的影響，這表明HPI毒力島與該菌的攝鐵能

5、力相關(guān)，并且這5株菌到達(dá)生長平臺期的時(shí)間沒有顯著性差異，這提示該HPI+大腸桿菌可能還存在其他的攝鐵系統(tǒng)。
　　 三是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定單基因缺失株和野生毒株對大腸桿菌毒力的影響，從而驗(yàn)證了這四個(gè)關(guān)鍵基因的相關(guān)作用，為進(jìn)一步研究豬源HPI+大腸桿菌奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。對30日齡ICR小鼠進(jìn)行分組，按濃度梯度分別利用這四個(gè)基因的原始野生毒株與缺失株接種小鼠，并設(shè)置陽性與陰性對照，接種后每隔12小時(shí)進(jìn)行一次觀察，連續(xù)觀察7天，以改良寇氏