丹黃方對(duì)急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)探討丹黃方對(duì)硫代乙酰胺所致急性肝衰竭大鼠肝損傷及肝再生的作用及機(jī)制。 (2)探討丹黃方對(duì)部分肝切除大鼠肝再生的作用及機(jī)制。 方法：(1)113只Wistar大鼠，雄性56只，雌性57只，體重230～250g，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(8只)、急性肝衰竭組(25只)、丹黃方大劑量組(20只)、丹黃方中劑量組(20只)、丹黃方小劑量組(20只)、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組(20只)。試驗(yàn)第2天除正常對(duì)照組皮下注射同等劑量的

2、生理鹽水外，其余各組用TAA600mg/kg-1體重皮下注射造模，24h后相同劑量重復(fù)注射1次。試驗(yàn)開(kāi)始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常組、急性肝衰竭模型組、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組予生理鹽水5ml·kg-1灌胃，丹黃方大、中、小劑量組分別給等體積/重量比的相應(yīng)藥物灌胃(三組分別給予丹黃方成人等效劑量、成人等效劑量的5倍、成人等效劑量的10倍劑量進(jìn)行灌胃)；除正常對(duì)照組外所有動(dòng)物每日皮下注射5ml混合液(10％葡萄糖3ml、含適量生理鹽水與20μmol/LKC

3、l2ml)以防低血糖，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組予促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素2mg/kg體重溶于上述防止低血糖的混合液中，每日皮下注射1次，持續(xù)3d，觀察造模后48h內(nèi)大鼠病死率。并于第2次注射TAA后24h后腹主動(dòng)脈采血測(cè)定肝功能(ALT、AST、TB)，ABC-ELISA法檢測(cè)血清TNF-α水平。迅速取肝組織，用10％甲醛液中固定，石蠟切片，檢測(cè)肝組織病理變化及有絲分裂指數(shù)。用鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化酶法(SP法)檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原、肝再生信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α1

4、和白細(xì)胞分化抗原14。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)白細(xì)胞分化抗原14mRNA的表達(dá)。 (2)雄性Wistar大鼠24只，體重230～250g，隨機(jī)分為正常組(假手術(shù)對(duì)照組)、模型組(肝切除手術(shù)組)、丹黃組和pHGF組4組，每組6只。大鼠自由喂養(yǎng)1周后，術(shù)前12h禁食，6h禁飲。丹黃組和pHGF組于手術(shù)前3天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每日1次分別腹腔注射生理鹽水4.0ml·kg-1體重、灌胃丹黃方10g·kg-1體重、和灌胃生理鹽水4.0ml·kg

5、-1體重、腹腔注射pHGF1ml/100g，假手術(shù)對(duì)照組、肝切除手術(shù)組模型組分別給予腹腔注射0.85％生理鹽水1ml/100g，同時(shí)兩組分別灌胃等體積的生理鹽水。按照Higgins和Panis等介紹方法無(wú)菌條件下操作。1％戊巴比妥鈉(用量40mg/kg體重-1)皮下注入麻醉動(dòng)物，固定在自制的簡(jiǎn)易手術(shù)臺(tái)上，剪去上腹部鼠毛，體積分?jǐn)?shù)為2％的碘酊消毒，體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇脫碘，蓋洞巾，在大鼠上腹部做一個(gè)縱形長(zhǎng)約1cm的切口，拉出左葉和中葉，

6、用手術(shù)線在左葉和中葉根部結(jié)扎，切除肝臟左葉和中葉(占70％)，術(shù)畢皮下給予生理鹽水1ml，縫合刀口，消毒。假手術(shù)組動(dòng)物僅開(kāi)腹翻動(dòng)肝左葉和中葉，不作肝葉切除，術(shù)后自由飲食水，所有動(dòng)物無(wú)1例死亡。除正常組大鼠僅進(jìn)行肝葉的牽拉，其余大鼠均進(jìn)行70％肝葉切除復(fù)制模型。48h后，殺死動(dòng)物，迅速取肝組織，采用異硫氰酸胍一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)細(xì)胞癌基因fosmRNA、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA、肝再生因子-1mRNA、神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘

7、導(dǎo)的抗增殖相關(guān)分泌蛋白mRNA、非受體型酪氨酸激酶mRNA和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：(1)丹黃方能明顯降低急性肝衰竭大鼠死亡率、肝功能(ALT、AST、TB)及TNF-α水平，改善肝組織病變，與模型組及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＜0.05或P＜0.01，有顯著差異。正常組大鼠肝組織MI、PCNA的表達(dá)水平較低，與模型組和pHGF組大鼠相比，差異顯著(P＜0.01)。丹黃方治療后，大鼠肝組織MI、PCNA的表

8、達(dá)，各劑量組明顯高于正常組(P＜0.01)，且隨著丹黃方劑量的增而增加，丹黃中、大劑量組大鼠肝組織MI、PCNA的表達(dá)，與模型組相比，明顯升高(P＜0.01)。正常組大鼠肝組織SIRPα1表達(dá)水平較低，模型組和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組大鼠與其相比，差異顯著(P＜0.01)。丹黃方治療后，大鼠肝組織SIRPα1的表達(dá)升高，丹黃方各劑量組SIRPα1的表達(dá)明顯高于正常組(P＜0.01)，且隨著丹黃方劑量的增加SIRPα1的表達(dá)增強(qiáng)，丹黃中、大劑量組

9、大鼠肝組織SIRPα1的表達(dá)，與模型組相比，明顯升高(P＜0.01)。丹黃方對(duì)TAA誘導(dǎo)的CD14表達(dá)有抑制作用，并呈劑量相關(guān)性。肝衰竭模型組CD14及CD14mRNA表達(dá)均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，t值分別為5.861，8.417，P＜0.01，提示內(nèi)毒素參與了肝衰竭的發(fā)生。經(jīng)丹黃方治療的肝衰竭大鼠，肝組織中CD14及CD14mRNA表達(dá)均較模型組顯著減弱，t值分別為4.265，5.379，P＜0.01。而促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組肝組織中CD14及C

10、D14mRNA表達(dá)與模型組比較無(wú)顯著變化，t=1.973，P＞0.05，提示促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的促肝細(xì)胞再生作用于內(nèi)毒素系統(tǒng)無(wú)關(guān)。 (2)丹黃方、pHGF均能促進(jìn)HGFmRNA表達(dá)，與手術(shù)組比較，差異顯著，t值分別為3.946、7.192，P＜0.05,P＜0.01；丹黃方的促進(jìn)HGFmRNA表達(dá)作用較pHGF組弱，但無(wú)顯著性差異，t=3.368，P＞0.05。丹黃方可顯著促進(jìn)TecmRNA表達(dá)，與手術(shù)組比較，t=10.08,P＜0

11、.01；且丹黃方的促TecmRNA表達(dá)作用顯著強(qiáng)于pHGF組，t=8.446,P＜0.01。與手術(shù)組比較，pHGF、丹黃方均能顯著促進(jìn)c-fosmRNA的表達(dá)，t值分別為2.458、2.746，均P＜0.05；丹黃方與pHGF組比較，無(wú)顯著性差異，t=0.288,P＞0.05,提示二者在促進(jìn)c-fosmRNA的表達(dá)方面無(wú)顯著性差異。丹黃方能促進(jìn)肝再生模型大鼠肝組織PC3mRNA，與手術(shù)組比較t=2.972,P＜0.01；與pHGF組比較

12、無(wú)顯著差異，t=0.102，P＞0.05。在LRF-1mRNA表達(dá)方面，各組間無(wú)顯著差異，提示丹黃方對(duì)LRF-1mRNA表達(dá)影響不顯著。手術(shù)部分切除肝組織后，TGF-β1mRNA水平較假手術(shù)組顯著升高,t=2.698,P＜0.05；與手術(shù)組比較，丹黃方、pHGF均能在一定程度上降低TGF-β1mRNA表達(dá)，但無(wú)顯著性差異，t值分別為0.909、0.304，均P＞0.05。 結(jié)論：(1)丹黃方能明顯降低急性肝衰竭大鼠死亡率、肝功能

13、(ALT、AST、TB)及TNF-α水平，增強(qiáng)大鼠肝組織有絲分裂指數(shù)、增殖細(xì)胞核抗原、肝再生信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α1的表達(dá)，抑制CD14及CD14mRNA的表達(dá)，丹黃具有改善急性肝衰竭大鼠肝損傷的作用。 (2丹黃方明顯促進(jìn)肝再生大鼠HGFmRNA、TecmRNA、c-fosmRNA及PC3mRNA的表達(dá)，與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.01)；丹黃方可上調(diào)LRF-1mRNA的表達(dá)，下調(diào)TGF-β1mRNA的表達(dá)，與模型組比較，但無(wú)顯