同種異體大鼠骨髓干細(xì)胞移植對(duì)急性肝衰竭大鼠治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化及鑒定方法。 2.研究不同途徑骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭的可行性。 方法： 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：取雄性SD大鼠骨髓細(xì)胞懸液，用Percoll(1.073g/L)分離液分離(2000r，25min)得到單個(gè)核細(xì)胞，以每只大鼠一個(gè)培養(yǎng)瓶，接種于容積75ml的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO<,2>飽和濕度條件下培養(yǎng)。第5天更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以

2、后每3天換液一次。細(xì)胞長到80％融合時(shí)胰酶消化傳代，以1：3比例傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。對(duì)所得的細(xì)胞進(jìn)行爬片后CD<,34>、CD<,44>免疫組化染色。 2.提取并標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：用Percoll(1.073g/L)分離得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁法對(duì)問充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行純化，培養(yǎng)3周，傳代3次；DAPI標(biāo)記細(xì)胞。 3.建立2-AAF肝損傷大鼠模型并移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：雌性清潔級(jí)封閉群SD大鼠60只，2-AAF以20mg/k

3、g/day，連續(xù)灌胃7天，后將2-AAF改為10mg/kg/day繼續(xù)灌胃，于第10天進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植手術(shù)。將其隨機(jī)分為10組，每組6只。分別為移植前組、移植后1周組、移植后2周組、移植組分為經(jīng)門靜脈和經(jīng)腹股溝靜脈組，各移植組設(shè)陰性對(duì)照組。向移植組大鼠的門靜脈和腹股溝靜脈各移植10<'7>個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，陰性對(duì)照組則注射等體積的生理鹽水。 4.肝功能檢測(cè)及TNF-a的檢測(cè)：細(xì)胞移植前及移植后1周及2周時(shí)，分別取實(shí)驗(yàn)各

4、組6只實(shí)驗(yàn)鼠心臟采血檢測(cè)血清白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶；并用ELISA法分別檢測(cè)各個(gè)組的TNF-a的值。 5．熒光顯微鏡觀察：移植后1周及2周處死實(shí)驗(yàn)鼠，分別取肝組織，制成5μm冰凍切片，熒光顯微鏡觀察DAPI染色陽性細(xì)胞是否在肝臟組織中存在。 6．組織病理觀察：取細(xì)胞移植前及移植后1周和2周的肝組織，10％甲醛固定，石蠟切片，HE染色，觀察組織病理改變。 結(jié)果： 1．間充質(zhì)干細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)7

5、2小時(shí)，去除未貼壁細(xì)胞，此時(shí)貼壁生長的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量稀少，散在存在，多呈細(xì)而小梭形，隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，10天左右細(xì)胞生長達(dá)80％-90％融合，其形態(tài)呈較均一的長梭形。將這些細(xì)胞再傳代3次，細(xì)胞擴(kuò)增近100倍，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。免疫組化法染色，CD<,34>陰性，CD<,44>陽性，證明得到的細(xì)胞是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞而非造血干細(xì)胞。 2．2-AAF處理10天時(shí)，大鼠體重明顯減輕，瞼結(jié)膜、鼻腔粘膜及唇周有出血，牙齒

6、松動(dòng)、變黑，精神萎靡，食欲減退。檢測(cè)血清肝功能示谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶均明顯升高，TNF-a升高。 3．2-AAF肝損傷大鼠，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后1周，移植組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶及血清TNG-a均有降低，血清白蛋白升高；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植2周后，細(xì)胞移植組血清白蛋白明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，經(jīng)門靜脈和腹股溝靜脈注射兩種移植方式結(jié)果相似。 4．實(shí)驗(yàn)鼠肝臟切片后在熒光顯微鏡下可以看到被DAPI熒光染色的細(xì)

7、胞5．肝組織病理檢查提示2-AAF可導(dǎo)致肝組織彌漫性損傷，鏡下可見細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，腫脹呈氣球樣變。細(xì)胞移植后隨著時(shí)間延長，肝組織病變逐漸改善。 結(jié)論： 1．密度離心法和細(xì)胞貼壁法能分離出較純的MSCs，MSCs可用免疫組化法鑒定。 2．大劑量2-AAF可造成大鼠肝組織彌漫性損傷，同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)2-AAF所致肝損傷有一定的治療作用。經(jīng)門靜脈和腹股溝靜脈移植干細(xì)胞的治療作用相當(dāng)。 3．體外傳代培