日本血吸蟲(chóng)Argonaute蛋白的初步研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的分布廣泛、危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體呈現(xiàn)獨(dú)特的代謝和發(fā)育特征及顯著的生物學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，必然存在不同的基因差異表達(dá)模式，非編碼小RNA在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，最近研究表明Argonuate家族蛋白參與此進(jìn)程。
　　 本研究利用RACE技術(shù)獲得2個(gè)編碼日本血吸蟲(chóng)Argonaute蛋白的全長(zhǎng)cDNA；利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析該基因在日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄情況

2、；構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-SiAGO1-PIWI和pET-32a-SjAGO1以及pET-28b-SjAGO2-PIWI，利用原核表達(dá)獲取重組保守功能域蛋白和全長(zhǎng)重組蛋白并制備相關(guān)抗體；利用免疫印跡方法和RNAi初步分析了日本血吸蟲(chóng)Argonaute蛋白的功能。結(jié)果表明：(1)RACE技術(shù)克隆獲得了編碼日本血吸蟲(chóng)Argonaute1蛋白(SjAGO1)的全長(zhǎng)cDNA，包含3030 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼1009個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)

3、分子量為111.7 kDa;生物信息學(xué)分析表明該基因編碼的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)域特征，且與人和鼠等Argonaute蛋白具有較高的同源性；熒光實(shí)時(shí)定量PCR表明該基因在7，14日齡的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)中轉(zhuǎn)錄較高；利用重組表達(dá)的保守功能域蛋白制備了特異性較高的多克隆抗體；免疫印跡分析表明SjAGO1在雄蟲(chóng)中高表達(dá)。(2)RACE技術(shù)克隆獲得日本血吸蟲(chóng)Argonaute2蛋白(SjAGO2)的全長(zhǎng)cDNA基因，包含2

4、808 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼935個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為106.0 kDa；生物信息學(xué)分析表明該蛋白與曼氏血吸蟲(chóng)AGO2相似性為83％；利用重組表達(dá)的保守功能域蛋白制備了特異性較高的多克隆抗體。免疫印跡分析該蛋白在成蟲(chóng)中尤其在雄蟲(chóng)中高表達(dá)。(3)RNA干擾SjAGO1基因后，干擾組蟲(chóng)體存活率僅為空白組的52.4％、39.2％、58.4％，蟲(chóng)體活力較低。熒光定量PCR表明干擾組日本血吸蟲(chóng)SjAGO1的轉(zhuǎn)錄量?jī)H為空白組的2.0％、4.5％

5、、3.2％，干擾組SjAGO1蛋白表達(dá)量明顯低于空白組。
　　 結(jié)論：本論文首次獲得2個(gè)編碼日本血吸蟲(chóng)Argonaute蛋白的基因，成功將SjAGO1和SjAGO2的保守結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，利用純化蛋白免疫昆明鼠制備了相應(yīng)抗體；成功篩選出對(duì)SjAGO1基因具有干擾作用的siRNA。本研究結(jié)果，為深入研究日本血吸蟲(chóng)Argonaute蛋白功能奠定了基礎(chǔ)，為深入揭示血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)，特別是童蟲(chóng)發(fā)育及性別發(fā)育成熟機(jī)制提供了新途徑，也