日本血吸蟲特異性酶蛋白的篩選、鑒定及重組表達.pdf

1、日本血吸蟲病是由日本血吸蟲感染所引起的人獸共患病，是我國的重點防治的傳染性疾病之一，主要流行于長江流域以南的12個省、市、自治區(qū)，其中湖南、湖北、安徽、江西、江蘇、四川及云南等7個省的疫情仍未得到完全的控制。我國的日本血吸蟲病的防治足以綜合防治為豐，結(jié)合吡喹酮藥物治療，但由于重復感染現(xiàn)象普遍，長期的應(yīng)用可能產(chǎn)生耐藥性，因此尋找新的藥物作用靶標和疫苗是日本血吸蟲病的研究重點之一。酶(enzyme)是由生物體內(nèi)細胞產(chǎn)生的一種生物催化劑，大部

2、分為蛋白質(zhì)少數(shù)為RNA組成，在十分溫和的條件下，高效率地催化機體中各種牛物化學反應(yīng)，促進生物體的新陳代謝。因此，尋找日本血吸蟲特異性酶類分子將為抗血吸蟲病新藥的篩選及疫苗的研制提供研究基礎(chǔ)。 研究目的 建立本地化的日本血吸蟲酶蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學篩選、識別和實驗分析，為日本血吸蟲病疫苗研究及新藥開發(fā)提供新的候選分子。 研究方法 1.日本血吸蟲酶蛋白數(shù)據(jù)庫的建立利用公共蛋白數(shù)據(jù)庫采集日本血吸蟲蛋

3、白序列所含有的信息，從日本血吸蟲蛋白序列中篩選出所有的日本血吸蟲酶蛋白序列。根據(jù)蛋白的酶促性質(zhì)以及GO分類方法對其分類，并將其gi號與分類進行關(guān)聯(lián)，從而建立本地的日本血吸蟲酶蛋白序列數(shù)據(jù)庫。 2.日本血吸蟲特異性酶蛋白的篩選與鑒定將日本血吸蟲酶蛋白序列與本地的蛋白數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，根據(jù)BLAST比對結(jié)果的特征，采用了相似性和E值兩個指標對比對結(jié)果進行篩選，獲得了6個可能的日本血吸蟲特異性酶蛋白序列，并采用RT-PCR和生

4、物信息學分析技術(shù)對其進行序列測定和分析。 3.日本血吸蟲特異性酶蛋白GST10的生物信息學分析GST10是從特異性酶蛋白中篩選出來的一種新的酶蛋白，對其一級結(jié)構(gòu)和拓撲結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、活性位點、抗原表位、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，直系及并系同源性進行了預測和分析。 4.GST10基因表達水平的研究利用半定量RT-PCR技術(shù)，對篩選出的GST10在日本血吸蟲的成蟲、蟲卵、尾蚴期的基因表達水平做相對定量分析。同時制備多個單條成蟲的

5、cDNA，以此為模板對GST10及其同家族的日本血吸蟲酶蛋白在不同蟲體的基因表達水平進行檢測。 5.GST10的重組表達及免疫學分析構(gòu)建GST10重組蛋白原核表達體系，對表達的重組融合蛋白進行SDS-PAGE分析檢測后，過層析柱純化。收集重組蛋白的免疫鼠血清及自然情況下日本血吸蟲感染人血清，利用Western-blot方法對重組融合蛋白的免疫原性與免疫反應(yīng)性進行鑒定。 結(jié)果 1.共獲得日本血吸蟲酶蛋白序列2302

6、條，并按照其信息采集的方式不同分為已知日本血吸蟲酶蛋白序列162條和未知日本血吸蟲酶蛋白序列2140條，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了完善的日本血吸蟲酶蛋白分類系統(tǒng)，建立了本地日本血吸蟲酶蛋白數(shù)據(jù)庫。 2.確立了特異性日本血吸蟲酶蛋白的篩選標準，與本地蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對后經(jīng)篩選得到了6條日本血吸蟲特異性酶蛋白。 3.采用RT-PCR方法對日本血吸蟲特異性酶蛋白進行了鑒定，同時按照疫苗候選分子所應(yīng)具有的特性從日本血吸蟲特異性酶蛋白中篩選

7、出了擁有GST_C家族結(jié)構(gòu)域的特異性酶蛋白，并將其命名為GST10。 4.對GST10的基因表達水平的研究提示該蛋白在成蟲、尾蚴的表達水平接近，明顯高于在蟲卵的表達水平。以單個體的成蟲eDNA為模板的RT-PCR結(jié)果提示GST10在日本血吸蟲成蟲中呈現(xiàn)高水平的表達，且該蛋白與同家族酶蛋白GST28和GST26在催化活性上存在一定的協(xié)同作用。 5.通過原核表達系統(tǒng)得到了純化的重組融合蛋白(re-GST10)，經(jīng)Wester

8、n-blot驗證，re-GST10可以被自然情況下日本血吸蟲感染人血清、重組的GST26免疫鼠血清及帶6個His標簽的重組GST10免疫鼠血清所識別，顯示出該融合蛋白具有很好的免疫反應(yīng)性。 結(jié)論 我們對2302個日本血吸蟲酶蛋白進行了篩選，從中獲得了6個特異性高的酶蛋白。對6個特異性酶蛋白的編碼基因進行了鑒定和初步的分析后從中獲得了一種具有GST_C家族結(jié)構(gòu)域的酶蛋白，根據(jù)其分子量被命名為GST10。該蛋白在日本血吸蟲的