褪黑素對馬桑內酯致癇大鼠海馬內SP及SPR水平的影響.pdf

1、癲癇(Epilepsy)是中樞神經系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，是中樞神經元反復陣發(fā)性過度放電的結果。癲癇患者腦內興奮性系統(tǒng)與抑制性系統(tǒng)失去平衡是癲癇發(fā)作的主要神經機制。褪黑素（melatonin，MT）是一種主要由丘腦松果體細胞合成、分泌的吲哚類神經內分泌激素。研究表明，MT能通過細胞膜上的特異性的MT受體發(fā)揮其抗癲癇作用，海馬及其亞區(qū)域內GABA神經元也能表達MT受體，這樣MT能通過增強GABA及其受體活性，抑制或減弱癲癇的發(fā)作，保護腦神經

2、。而MT膜受體競爭性拮抗劑Luzindole能夠阻斷MT的抗驚厥作用、抑制癲癇發(fā)作的作用。P物質（Substance P，SP）屬于速激肽家族，能參與癲癇的發(fā)作。大量研究發(fā)現(xiàn)P物質能與抑制性神經遞質GABA共存于海馬主要神經元。以上這些提醒我們MT的抑癇過程中可能會對SP\SPR產生影響。但是目前MT的抗癇作用機制尚未完全闡明。 為進一步研究MT的抑癇作用，本研究在馬桑內酯致癇的癲癇大鼠模型基礎上，采用免疫細胞化學和RT－PCR方

3、法，從細胞和基因水平觀察了MT對癲癇大鼠海馬內SP及SPR水平的變化，以進一步探討MT的抑癇作用機制。 首先，免疫組化用40只健康SD雄性大鼠，隨機分為四組，每組10只，分別為A組：生理鹽水對照組；B組：馬桑內酯致癇組；C組：褪黑素＋馬桑內酯組；D組：Luzindole＋褪黑素＋馬桑內酯組。參照Smialowaki的評論標準分級，觀察記錄大鼠行為學表現(xiàn)，用免疫組化方法（SABC法）檢測海馬內SP及SPR含量的變化，最后再用20只

4、健康SD雄性大鼠（每組5只，動物模型及分組與免疫組化相同），采用SYBR Green 1熒光PCR方法，對各組大鼠海馬內SP mRNA進行相對定量后，在基因水平比較MT對SP mRNA表達的影響。結果顯示，行為學表現(xiàn)上：A組幾乎無癲癇發(fā)作的表現(xiàn)和癇樣放電，B組D組幾乎都有癲癇發(fā)作且發(fā)作程度極強（Ⅳ－Ⅴ級），發(fā)作持續(xù)時間長。而A、C組大鼠幾乎無癲癇發(fā)作或僅有輕微發(fā)作表現(xiàn)；免疫化學觀察：各組大鼠海馬CA1－CA3區(qū)錐體細胞層和DG顆粒細胞層

5、神經元中均有SP與SPR免疫陽性表達。在高倍光鏡下，SP陽性細胞表達于神經元胞體的胞漿中，胞核空染。在高倍鏡下，SPR陽性細胞表達于神經元細胞胞體的胞漿及軸突中，胞核空染。還可見較長神經纖維深染。檢測SP的各組之間比較：B組（CL組）、D組（LU組）SP的免疫反應明顯強于A組（對照組）（P＜0.05），C組與B組、D組相比SP陽性細胞免疫明顯減弱，陽性細胞著色變淺，數(shù)目減少，統(tǒng)計學結果P＜0.05，認為有明顯差別。C組與對照相比沒有明顯

6、差別（P＞0.05）。檢測SPR的各組之間比較：B組（CL組）、D組（LU組）SP的免疫反應明顯強于A組（對照組）（P＜0.05），C組與B組、D組相比SP陽性細胞免疫明顯減弱，陽性細胞著色變淺，數(shù)目減少，統(tǒng)計學結果P＜0.05，認為有明顯差別。C組與對照相比沒有明顯差別（P＞0.05）。實時熒光定量PCR采用2－△△CT法計算各組SP基因表達的差異，B組或D組大鼠與A組相比，海馬內SP mRNA明顯升高，統(tǒng)計學結果P＜0.05。C組大

7、鼠與B組或D組相比，海馬內SP mRNA相對含量明顯減少，統(tǒng)計學結果P＜0.05。C組大鼠與生理鹽水對照組比幾乎無差別統(tǒng)計學結果P>0.05。本實驗結果顯示，CL致癇組大鼠海馬內SP/SPR含量明顯升高，SP/SPR確實參與癲癇發(fā)作。在使用褪黑素預處理大鼠后，大鼠在癲癇發(fā)作嚴重程減弱，癲癇發(fā)作的耐受性明顯增強。免疫組化所示：褪黑素預處理的大鼠海馬內，SP免疫反應明顯減弱?；蛩降臋z測顯示：褪黑素能減少癲癇大鼠腦內SP mRNA的量。行

8、為學表現(xiàn)、形態(tài)學表現(xiàn)、基因水平的檢測結果都互相吻合。而先用MT受體拮抗劑Luuzindole預處理的大鼠癲癇發(fā)作再次增強，海馬內SP/SPR表達比C組大鼠明顯增強，說明MT是通過其特異性受體發(fā)揮抑癇作用的。因此我們認為，褪黑素的抑制癲癇作用機制中，確實有對SP及SRR的參與。MT可能通過與特異性的G蛋白膜受體結合后，調節(jié)大鼠海馬內SP及SRR的含量及活性來抑制癲癇發(fā)作。 綜上所述，MT對馬桑內酯致癇大鼠有明顯的抑制作用，可能通過