BLyS突變體的構(gòu)建、表達(dá)、純化和功能鑒定.pdf

1、B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)是TNF家族中的一員，又稱為B細(xì)胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，可溶性BLyS(sBLyS)能夠特異性作用于B細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞分化、增殖和存活。如果敲除BLyS，小鼠體內(nèi)的T1期B細(xì)胞相對(duì)正常，T2期和成熟B細(xì)胞缺失。因此，BLyS在B細(xì)胞的成熟過

2、程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。而在BLyS過量表達(dá)時(shí)，小鼠表現(xiàn)出自身免疫性疾病樣癥狀，提示BLyS與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。新近的研究發(fā)現(xiàn)，部分B細(xì)胞型腫瘤細(xì)胞能夠合成BLyS。分泌的BLyS，可能與自身細(xì)胞的BLyS受體結(jié)合，形成自分泌途徑，參與B細(xì)胞腫瘤的生長與存活。因此，BLyS的拮抗劑可能成為治療自身免疫疾病和某些腫瘤的新型藥物。
　　 首先，我們根據(jù)BLyS與其受體的相互作用結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出五個(gè)BLyS的突變體，以pET2

3、2b(+)/sBLyS為模板擴(kuò)增BlyS的突變體，然后，將突變體基因酶切下來，連接到原核表達(dá)載體pET32a(+)，進(jìn)行表達(dá)、純化，得到五個(gè)BLyS突變體蛋白(M1、M2、M3、M4、M5)。我們?cè)O(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BLyS突變體的功能。第一組實(shí)驗(yàn)：通過MTT比色法，用BLyS及其突變體刺激小鼠脾細(xì)胞來檢測(cè)他們的功能；第二組實(shí)驗(yàn)：將BC/PC質(zhì)粒(BC/PC質(zhì)粒為可表達(dá)BCMA蛋白的質(zhì)粒)和NF-κB-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞，當(dāng)