用于藥物篩選的mGluR2突變體和用于失敏機(jī)制研究的mGluR5突變體的構(gòu)建及其功能檢測.pdf

1、代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors,mGluRs)屬于C族GPCRs,其功能異?？蓪?dǎo)致老年癡呆癥,焦慮,沮喪,精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。mGluRs在體內(nèi)為同源二聚體,每個單體都包括與配體結(jié)合的VFT區(qū)(Venus flytrapmodule),七次跨膜區(qū)(heptahelical domain,HD)、連接VFT與HD區(qū)的富含半胱氨酸區(qū)(Cys-rich domain,CRD)以及胞

2、內(nèi)的C末端。mGluRs的活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到配體和變構(gòu)劑的調(diào)控,它操作性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)和重要的生理功能使之成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要藥物靶點。除了受到外源性配體的調(diào)控,mGluRs的信號活性及轉(zhuǎn)導(dǎo)也受到細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白的調(diào)控。
　　負(fù)向變構(gòu)劑(Positive Allosteric Modulator,PAM)類藥物的低毒性和高種屬特異性使它成為近年來藥物研發(fā)的熱點,但因其研發(fā)過程需要加入激動劑和PAM兩種化合物,這所帶來的高工作量及

3、高信噪比給研發(fā)帶來了困難。而去除VFT區(qū)的mGluRs可以被PAM單獨激活,以此模型篩選藥物無疑大大降低的工作量和信噪比。由于不同的受體偶聯(lián)不同的信號通路,所以傳統(tǒng)的藥物篩選方法具有較低的普適性。這里我們通過去除VFT區(qū)并插入SNAP/CLIP標(biāo)簽的mGluR2的突變體來建立篩選PAM類的候選細(xì)胞模型。VFT區(qū)的去除避免了篩選PAM過程中需要加入激動劑帶來的額外工作量和高信噪比,而使用基于SNAP/CLIP的TR-FRET避免了檢測不同

4、下游信號通路帶來的低普適性。這里我們構(gòu)建了去除VFT區(qū)的一系列候選細(xì)胞模型,包括VFT區(qū)或CRD區(qū)的去除,mGluR2的N端和e2-loop的SNAP/CLIP標(biāo)簽的插入以及C1KKXX,C2KKXX尾巴的替換。鑒于各突變可能會對受體的表達(dá)量尤其是膜表達(dá)量產(chǎn)生影響,我們檢測了各個突變體的表達(dá)情況。另外,我并確定了去除VFT而保留CRD的突變體具有功能,并且其信號強(qiáng)度高于同時去除VFT和CRD的突變體的。
　　根據(jù)報道,GRK2介導(dǎo)

5、的mGluR1的脫敏需要mGluR1,Gαq和GRK2三者的相互作用。這里我們利用GRK2的突變體RH,PH,D110A等證明了單獨的RH結(jié)構(gòu)域的表達(dá)即可介導(dǎo)mGluR5的脫敏,這說明是GRK2的RH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)mGluR5的脫敏。同時我們發(fā)現(xiàn)失去和mGluR5結(jié)合能力的D110A不能介導(dǎo)mGluR5的脫敏,這說明GRK2與Gαq的直接相互作用是GRK2介導(dǎo)mGluR5脫敏的必要條件。另外,我們利用GRK2的突變體D527A證明GRK2介