N-端引入RGD序列的葡激酶突變體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及性質(zhì)研究.pdf

1、血栓性疾病特別是腦血栓、心肌梗塞、深度靜脈血栓等均有較高的致死、致殘率，溶栓治療法是治療此類疾病的常規(guī)療法。自從二十世紀(jì)八十年代以來(lái)，已先后開發(fā)了多種溶栓制劑，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于臨床，例如：重組組織型纖溶酶原(recombinant tissue-typeplasminogen activator，rt-PA)、尿激酶(UK)、重組鏈激酶(recombinant streptokinase，r-SK)等，這些溶栓制劑各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中以rt

2、-PA療效最佳，但因其價(jià)格昂貴使用范圍受到很大限制?？蒲泄ぷ髡哒谂ふ乙环N既有較好溶栓療效價(jià)格又便宜的新一代溶栓制劑。 天然葡激酶(staphylokinase，SAK)是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種蛋白質(zhì)。臨床研究表明，重組葡激酶(r-SAK)具有與rt-PA相當(dāng)?shù)娜芩ɑ钚?，且有更高的纖維蛋白專一性，除此之外，它能在大腸桿菌中高效表達(dá)，生產(chǎn)成本低，是一種很有應(yīng)用前景的溶栓制劑。但臨床試驗(yàn)表明，使用r-SAK后仍有一

3、定的再梗塞率，而活化后血小板聚集反應(yīng)是成功溶栓后再栓塞的主要原因，因此在溶栓的同時(shí)進(jìn)行抗凝、抗血小板聚集治療是一種積極的預(yù)防再栓塞的治療策略。GPIIb/IIIa拮抗劑能與纖維蛋白原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合血小板表面的GPIIb/IIIa受體，能夠抑制血小板聚集通路的最后一步，具有很強(qiáng)的抑制血小板聚集的作用。國(guó)內(nèi)外根據(jù)RGD(Arg-Gly-Asp)序列已設(shè)計(jì)了許多GPIIb/IIIa受體阻斷劑，用于抑制血小板聚集。 為研制兼具溶栓和防栓功能

4、的新型溶栓劑，降低溶栓后再栓塞的發(fā)生率，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)在SAK分子的N-端引入RGD序列，構(gòu)建四個(gè)新型雙功能SAK突變體分子，研究其表達(dá)和純化，并分析其生物學(xué)活性。 本實(shí)驗(yàn)采用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變的方法，通過(guò)設(shè)計(jì)N-端包含RGD短肽序列的突變引物，以野生型葡激酶(wild type staphylokinase，WT-SAK)質(zhì)粒為模板，PCR克隆得到SAK突變體基因；將突變后的SAK基因序列與表達(dá)載體pBV220質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化大

5、腸桿菌BL2l進(jìn)行表達(dá)：應(yīng)用陽(yáng)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和陰離子交換層析連續(xù)三步層析法純化表達(dá)產(chǎn)物，并對(duì)所得純化產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAK突變體蛋白在大腸桿菌BL2l中的表達(dá)量占菌體蛋白總量的50％以上；三步連續(xù)層析純化后其純度可達(dá)97％以上；測(cè)得其纖溶比活性分別為10.8×104mJ/mg、10.1×104HU/mg、11.0×104HU/mg、11.2×104HU/mg，不低于WT-SAK的纖溶活性(9.8×104

6、HU/mg)；并且具有明顯的抗血小板聚集活性，實(shí)驗(yàn)測(cè)得血小板聚集抑制率分別為10.72％、12.36％、19.71％、21.65％，明顯高于WT-SAK(3.98％)；ELISA分析結(jié)果表明，SAK突變體中大腸桿菌菌體蛋白殘留量均小于0.1％，符合《中國(guó)藥典》2005版中規(guī)定的要求。本實(shí)驗(yàn)中，突變體基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，得到了高純度、高活性的SAK突變體蛋白。突變體既保留了野生型葡激酶的纖溶活性，同時(shí)又具有了抗血小板聚集功能，為