DATS通過(guò)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生ROS激活JNK的分子機(jī)制.pdf

1、目的:探討DATS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞JNK活化的分子機(jī)制及活性氧在這一過(guò)程中的作用。
　　方法:用濃度為50、100、150μM的DATS處理HL-60細(xì)胞0、0.5、1、3、6、12h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)預(yù)孵育HL-60細(xì)胞30min后,再用150μM DATS處理HL-60細(xì)胞0、0.5、1、3、6、12h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS

2、水平;蛋白印跡法檢測(cè)JNK、c-Jun、GST-π和JIP的表達(dá)及JNK、c-Jun和MLK3的磷酸化水平;免疫共沉淀和蛋白印跡技術(shù)分析GST-π與JNK、JIP與JNK的結(jié)合情況;用MLK特異性阻滯劑CEP-1347或JNK特異性阻滯劑SP600125預(yù)處理后,觀察150μM DATS處理細(xì)胞3h后,HL-60細(xì)胞JNK、c-Jun磷酸化的變化。
　　結(jié)果:不同濃度DATS處理HL-60細(xì)胞不同時(shí)間后,細(xì)胞流式檢測(cè)顯示ROS的產(chǎn)

3、生與DATS處理呈時(shí)間劑量依賴關(guān)系,在0.5-3h隨著DATS處理時(shí)間和濃度的升高而升高,ROS的熒光強(qiáng)度在3h、150μM時(shí)達(dá)到最高峰,值為89.7±3.67,其后維持在一個(gè)較高水平。
　　DATS處理HL-60細(xì)胞在12h內(nèi),幾乎不影響JNK蛋白的表達(dá),c-Jun蛋白表達(dá)在前3h內(nèi)有所增高,隨后趨于穩(wěn)定;JNK的磷酸化水平在 DATS處理3h內(nèi)顯著增高,3h達(dá)到最高峰,隨后稍有下降;c-Jun、MLK3的磷酸化水平隨著時(shí)間的延

4、長(zhǎng)而增加,NAC能不同程度的抑制DATS誘導(dǎo)的c-Jun的表達(dá)及JNK、c-Jun的磷酸化;CEP-1347預(yù)處理細(xì)胞能降低DATS誘導(dǎo)的JNK的磷酸化水平,SP600125預(yù)處理細(xì)胞能顯著降低DATS誘導(dǎo)的c-Jun的磷酸化水平。
　　DATS處理細(xì)胞6h內(nèi),幾乎不影響GST-π的表達(dá),12h時(shí),DATS能抑制GST-π的表達(dá);DATS處理幾乎不影響JIP的表達(dá);DATS處理HL-60細(xì)胞0-3h,DATS能誘導(dǎo)GST-π與JN

5、K復(fù)合物的解離,3h時(shí)GST-π與JNK基本處于解離狀態(tài),3h后GST-π重新與JNK結(jié)合,NAC能顯著抑制DATS誘導(dǎo)的GST-π與JNK復(fù)合物的解離;DATS處理HL-60細(xì)胞0-3h,DATS能誘導(dǎo)JIP與JNK復(fù)合物的形成,3小時(shí)以后JIP與JNK復(fù)合物逐漸解離。NAC對(duì)JIP與JNK復(fù)合物的形成無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.DATS能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生ROS及MLK3、JNK和c-Jun的磷酸化;