HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化后VEGF表達(dá)變化的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 作為目前已知最重要的正性血管生成調(diào)節(jié)因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)血管的滲透性，有利于腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。1971年Folkman首次提出腫瘤的血管生成(angiogenesis)這一觀點(diǎn)。不久VEGF信號(hào)通路就被確定為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。人們對(duì)實(shí)體瘤中VEGF信號(hào)通路的研究比較深入，如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，PI3K/AKT信號(hào)通路，p38MAPK信

2、號(hào)通路，JNK/STAT信號(hào)通路，NF-κB信號(hào)通路，DLL4-Notch信號(hào)通路等。同樣在白血病中也存在明顯的血管新生現(xiàn)象，表現(xiàn)為骨髓微血管密度(MVD)的增高，并且伴有VEGF表達(dá)水平的升高。但是，白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)分泌的機(jī)制，以及靶向VEGF調(diào)控在白血病細(xì)胞增殖分化中的作用至今沒有明確。
　　 目的：
　　 基于上述理論背景，本研究建立ATRA誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞分化的模型，在該細(xì)胞模型中V

3、EGF表達(dá)水平下降，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討VEGF表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵分子機(jī)制，從腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子出發(fā)，檢測(cè)其與VEGF表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，篩選出調(diào)控VEGF表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄因子，探索新的基因靶點(diǎn)，擬為白血病的治療開辟新的治療道路。
　　 方法：
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，加入lμMATRA，于37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)96小時(shí)，Wright-Gimesa染色觀察HL-60細(xì)胞形態(tài)，硝基四唑氮藍(lán)(NBT)還原實(shí)驗(yàn)檢

4、測(cè)HL-60細(xì)胞分化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CDllb的表達(dá)和HL-60細(xì)胞周期，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)HL-60細(xì)胞增殖，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HL-60細(xì)胞VEGF、c-myc的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)CDllb、VEGF、HIF-1α、STAT3、c-myc、P53、VHL、COX-2、SP-1和AP-1mRNA的表達(dá)，蛋白質(zhì)印記(Westemblot)檢測(cè)細(xì)胞VEGF、STAT3、c-myc的蛋白表達(dá)。RN

5、A干擾（RNAi）檢測(cè)STAT3、c-myc與VEGF的關(guān)系，染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)進(jìn)一步驗(yàn)證c-myc與VEGF啟動(dòng)子的結(jié)合情況。測(cè)定結(jié)果用x±s表示，均數(shù)比較采用f檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜O.01為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 lμMATRA作用96小時(shí)可顯著抑制HL-60細(xì)胞的增殖，并出現(xiàn)明顯的分化現(xiàn)象，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞明顯向成熟粒細(xì)胞方向分化；免疫細(xì)胞化

6、學(xué)法顯示VEGF表達(dá)量明顯下降；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，處于G0/G1期的比例高達(dá)77.31％;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記CDllb表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；NBT陽(yáng)性率為82.59％(P＜0.01)；RT-PCR檢測(cè)VHL基因表達(dá)無(wú)明顯變化（p＞0.05），HIF-1α、P53、COX-2、SP-1和AP-1mRNA表達(dá)水平升高；RT-PCR及Westemblot檢測(cè)VEGF、STAT3和c-mycmRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯

7、下降(P＜0.05);RNAi結(jié)果顯示阻斷c-myc基因的表達(dá)，VEGF基因的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05);ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證c-myc與VEGF啟動(dòng)子的結(jié)合情況。
　　 結(jié)論：
　　 在ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的模型中VEGF的表達(dá)水平隨誘導(dǎo)分化的進(jìn)程而下降，VEGF的下調(diào)可能與c-myc、STAT3具有顯著相關(guān)性，而且c-myc可能結(jié)合于VEGF啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控VEGF的表達(dá)。HIF-1α、P53、VH